烏珠穆沁羊生長過程中肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白的變化

吳瓊　呂雅瓊　張冬梅　格日勒圖

摘 要：采用1至18月齡不同生長階段烏珠穆沁羊為研究對象，對其骨骼肌內(nèi)結(jié)締組織中提?、笮湍z原蛋白，并進行SDS-PAGE電泳鑒定，利用高效液相色譜測定所提取的Ⅲ型膠原蛋白中三種主要氨基酸含量，并依據(jù)羥脯氨酸含量計算出Ⅲ型膠原蛋白的含量，通過SAS軟件分析肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白隨月齡增加的變化規(guī)律。結(jié)果表明，隨著烏珠穆沁羊月齡的增加，骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織Ⅲ型膠原蛋白中甘氨酸和脯氨酸含量顯著下降

（P<0.05），羥脯氨酸含量顯著增加（P<0.05）。Ⅲ型膠原蛋白的含量隨著月齡的增加而顯著增加（P<0.05）。本研究對家畜生長過程中肌內(nèi)結(jié)締組織中膠原蛋白的性質(zhì)、以及膠原蛋白對肉品質(zhì)的影響起重要的作用。

關(guān)鍵詞：烏珠穆沁羊；骨骼??；肌內(nèi)結(jié)締組織；Ⅲ型膠原蛋白

Changes of Type Ⅲ Collagen in Intramuscular Connective Tissue during Growth of Ujumqin Sheep

WU Qiong， Lü Ya-qiong， ZHANG Dong-mei， BORJIGIN Gerelt*

（College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot 010018， China）

Abstract： Ujumqin sheep， aged from 1 to 18 months， were employed in this study. The type Ⅲ collagen of intramuscular connective tissue was extracted and identified by SDS-PAGE， also three major amino acids were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）， and then the content of type Ⅲ collagen was calculated based on hydroxyproline. The changes of type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissue during growth of Ujumqin sheep were analyzed by SAS software. The results showed that the glycine and proline contents in type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissues were decreased significantly with increasing age of Ujumqin sheep （P < 0.05）， whereas the hydroxyproline content was increased significantly （P < 0.05）. In addition， the content of type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissues showed a significant increase with the age of Ujumqin sheep （P < 0.05）.

Key words： Ujumqin sheep； skeletal muscle； intramuscular connective tissues； Type Ⅲ collagen

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）05-0001-05

肌內(nèi)結(jié)締組織的主要成分、膠原蛋白占動物體全蛋白質(zhì)的1/4～1/3。因動物的種類、性別、肌肉類型和不同生長階段中膠原蛋白含量各不相同。肌外膜、肌束膜以及肌內(nèi)膜有它們獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)構(gòu)其應(yīng)對它各自的機能而形成。這些形態(tài)結(jié)構(gòu)特征因構(gòu)成膠原蛋白細纖維的三維結(jié)構(gòu)排列的不同而有所差異。膠原蛋白是由3條多肽鏈以特有的右旋，形成螺旋狀的膠原蛋白分子，構(gòu)成的多肽鏈叫α鏈。膠原蛋白有許多種遺傳性變異體。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ型膠原蛋白廣泛分布于骨骼肌肌束膜和肌內(nèi)膜之中，Ⅳ型在肌內(nèi)膜、特別是基底膜的稠密層里存在。Ⅰ型主要存在肌束膜，Ⅲ型以及Ⅴ型在肌束膜和肌內(nèi)膜中的存在。因結(jié)構(gòu)的不同，有可能食肉質(zhì)地之間有某種程度的相關(guān)關(guān)系。Nishimura等[1]報道牛生長過程中的不同類型膠原蛋白的變化和存在位點。Listrat等[2]在豬、兔、生長110d和成年牛骨骼肌中前后發(fā)現(xiàn)了Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型5種膠原蛋白。據(jù)報道[3]，Ⅲ型膠原蛋白是纖維型膠原蛋白的胚胎形式，隨著動物的成熟Ⅲ型膠原蛋白逐漸被Ⅰ型膠原蛋白和具有更成熟交聯(lián)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白所代替。所以Ⅰ型和Ⅲ型膠原在不同年齡動物肌肉中含量不同且還可能相互轉(zhuǎn)換。家畜的不同飼養(yǎng)管理、不同生長速度和飼草料以及血統(tǒng)的不同也影響膠原蛋白特性[3]。隨著動物的生長膠原蛋白交聯(lián)形成的程度增加。這主要受家畜品種、年齡、肌肉部位以及飼養(yǎng)等因素的影響。膠原蛋白總含量、膠原蛋白類型、分子之間的交聯(lián)形成、熱穩(wěn)定性等影響食肉品質(zhì)的一個重要因素。Ngapo等[4]發(fā)現(xiàn)比利時牛雜交雙層肌肉牛和純種雙層肌肉牛的半腱肌和股二頭肌中的膠原蛋白含量和膠原蛋白交聯(lián)濃度也有所差異。Shiba等[5]對山羊肌肉中的速肌之腓腸肌和慢肌的比目魚肌中膠原蛋白和膠原吡啶交聯(lián)濃度的變化進行比較研究時發(fā)現(xiàn)，出生之前兩種骨骼肌中的總膠原蛋白的百分比可溶性膠原蛋白濃度顯著下降，之后下降比率慢慢緩解。青春前期之間兩種骨骼肌中總膠原蛋白的膠原吡啶交聯(lián)濃度增加，但比目魚肌中膠原吡啶交聯(lián)濃度與腓腸肌相比增加的快而濃度高。膠原吡啶交聯(lián)濃度的增加是出生前期之間開始，而且隨著年齡的增加交聯(lián)程度的發(fā)達比目魚肌中的比腓腸肌的快。

本研究采用我國優(yōu)良地方品種烏珠穆沁羊，研究生長過程中骨骼?、笮湍z原蛋白變化。以往對羊肉的相關(guān)研究主要集中在宰后肉的成熟、飼草料與肉風(fēng)味之間的關(guān)系方面研究較多。而對家畜生長過程中不同類型膠原蛋白在肌內(nèi)結(jié)締組織中含量方面的研究極少。已有文獻對烏珠穆沁羊生長過程中肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白含量和熱溶解、蛋白多糖、膠原蛋白細纖維變化、吡啶諾林含量、糖醛酸含量、肌纖維類型變化以及Ⅰ型膠原蛋白等方面進行了探討過[6-9]。因此，在此研究基礎(chǔ)上進一步探討烏珠穆沁羊的骨骼肌中Ⅲ型膠原蛋白的含量進行探討。以及不同月齡肉羊的骨骼肌進行對比研究。這對掌握烏珠穆沁羊的肌內(nèi)結(jié)締組織的變化規(guī)律和烏珠穆沁綿羊的產(chǎn)肉性能的改變和肉質(zhì)量的提高、食肉嫩化成熟機理研究等提供重要的科學(xué)理論依據(jù)。對于畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)食品加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇自然放牧條件下的1、3、6、9、12 月和18 月齡的烏珠穆沁羊，所選的各月齡肉羊是同一個羊群中年齡相同的去勢公羊，每個月齡選用3 只。屠宰后采取股二頭肌，將樣品直接投入液氮中速凍，放置在-80 ℃條件下保存。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS） 南京博爾迪生物科技有限公司；鹽酸胍 上海生工生物；β-巰基乙醇、胃蛋白酶（Pepsin）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、溴酚藍、羥脯氨酸對

照品 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、苯基甲烷磺酰氟化鈉（PMSF）、考馬斯亮藍R-250 加拿

大BIObasic Inc生物工程公司；對甲氧基苯磺酰氯（MOBS-Cl）、脯氨酸對照品（L-proline） 成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；甘氨酸對照品 上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Arium 61316超純水器 德國賽多利斯儀器廠；XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物公司；H2500R-2型冷凍高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；BG-power 600型穩(wěn)流恒壓電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；LGJ-10C型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；pB-10型pH計 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DSH-300A型回旋式恒溫水浴振蕩器 上海

雅榮生化設(shè)備有限公司；GRX-9253A型熱空氣消

毒箱 上海一恒科技有限公司；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-800TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 Ⅲ型膠原蛋白的提取

參考久保木方德[10]、永井裕[11]和Fujii等[12]的方法進行提取。取肌肉組織20 g，實驗時4 ℃下解凍，除去外側(cè)脂肪和肌外膜；破碎，將肉樣置于燒杯中加入10倍量（V/V）的洗凈液（1 mL β-巰基乙醇，1 mL PMFS，5 mL EDTA，3.582 g Na2HPO4，用蒸餾水定容至1 L）充分攪拌之后破碎均質(zhì)；離心（5000 r/min，15 min），去除上清液，沉淀上加肉樣的10倍量（V/V）洗凈液，緩慢攪拌3～10h后離心；重復(fù)5～7次，直到上清液透明為止。去除上清液，沉淀上加肉樣10倍量（V/V）抽出液（1 mg/mL

胃蛋白酶-0.5 mol/L醋酸），緩慢攪拌室溫下過夜；離心（10 000 r/min，20 min），將上清移入燒杯中，緩慢攪拌并加入粉末狀NaCl，使終濃度達到2 mol/L，

室溫過夜；離心（10 000 r/min，20 min），去除上清液，沉淀用10倍量50 mmol/L醋酸溶液溶解；離心，上清液加入粉末狀NaCl，使終濃度達到1 mol/L，緩慢攪拌過夜；離心后用沉淀的10倍量50 mmol/L醋酸溶液溶解，分別用 0.45 mol/L NaCl-5 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液和1.2 mol/L NaCl-5 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液透析12 h；高速離心，取沉淀，4 ℃用蒸餾水透析12 h，離心（100000×g，1 h），取沉淀（Ⅲ型膠原蛋白）備用。

1.3.2 利用聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）對Ⅲ型膠原蛋白純度的鑒定

參考Leammli[13]的方法對凍干的各月齡Ⅰ型膠原蛋白樣品進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳[10]。分別配制8%的分離膠和5%的濃縮膠溶液。凝膠后，用微量取樣器吸取已處理好的蛋白質(zhì)樣品12 μL，分別單個注入膠孔。保持恒壓100 V，進行電泳。電泳結(jié)束后，加入染色液過夜，次日傾出染色液，用蒸餾水漂洗2次，然后加入脫色液，室溫浸泡凝膠，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止，采集圖像。

1.3.3 利用高效液相色譜測定Ⅲ型膠原蛋白中3種主要氨基酸含量

參考周桂友等[14]、崔琳等[15]的方法測定Ⅰ型膠原蛋白中羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量。將凍干的Ⅲ型膠原蛋白溶于6 mol/L HCl溶液中，110 ℃水解12 h，冷卻，用6 mol/L NaOH溶液中和后取膠原蛋白水解液1 mL，加入5 mL乙腈，超聲振蕩20 min，然后在離心機中以5 000 r/min

離心10 min。取離心后上清液200 μL加入200 mmol/L

Na2HPO4溶液1 mL和500 μmol/L MOBS-Cl溶液200 μL使其充分混合，混合物在45 ℃恒溫振蕩反應(yīng)35 min。冷卻后，上層溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進入高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

色譜條件：SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流動相組成：A相為磷酸緩沖液（15 mmol/L，

pH3.5），B相為乙腈（使用前過0.22 μm濾膜），梯度洗脫：0～8 min，17%～34% B，8～10 min，34%～40% B，10～15 min，40% B，15～20 min，40%～17% B；流動相流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測器檢測波長232 nm。

1.3.4 各月齡烏珠穆沁羊肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白含量測定

參考Grant[16]的方法計算Ⅲ型膠原蛋白百分含量：膠原%=HYP%×7.46（7.46為換算常數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析Ⅲ型膠原蛋白

1. 1月齡；2. 3月齡；3. 6月齡；4. 9月齡；5. 12月齡；6. 18月齡。

圖 1 骨骼?、笮湍z原蛋白的SDS-PAGE電泳圖

Fig.1 SDS-PAGE profile of type Ⅲ collagen of skeletal muscles

由圖1可知，Ⅲ型膠原在SDS-PAGE凝膠上得到清晰的分離，條帶中顯示出一條α（Ⅲ）肽鏈與一條β（Ⅲ）肽鏈，其中β（Ⅲ）肽鏈是α（Ⅲ）的二聚體，基本符合Ⅲ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征，可以初步判定所提取的膠原蛋白為Ⅲ型膠原蛋白。圖中各月齡條帶深淺基本一致，可以說明Ⅲ型膠原蛋白各月齡之間變化不大。

2.2 膠原蛋白中三種主要氨基酸含量測定結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察

取羥脯氨酸13.1 mg、脯氨酸11.5 mg、甘氨酸7.5 mg，置100 mL容量瓶中，用200 mmol/L pH 9.3的Na2HPO4衍生緩沖液配制成1 mmol/L標準液，分別稀釋成濃度為2、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L的標準溶液。定量移取每種氨基酸1 mL于10 mL具塞試管內(nèi)，加入MOBS-Cl的乙腈溶液（500 μmol/L）2 mL，混勻，蓋緊瓶塞后將其放入45 ℃水浴鍋中恒溫振蕩35 min。進樣前用0.22 μm濾膜過濾。按上述色譜條件，移取標準系列反應(yīng)液各20 μL進樣，以峰面積值（A）為縱坐標，氨基酸濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程（表1）。

2.2.2 膠原蛋白中3種主要氨基酸含量測定

1.脯氨酸（proline）2.甘氨酸（glycine）3.羥脯氨酸（hydroxyproline）

圖 2 對照品（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖

Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances （A） and sample （B）

按照建立的HPLC方法分別對實驗中提取的各月齡（1、3、6、9、12、18月齡）的Ⅲ型膠原蛋白中3種主要氨基酸，即羥脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量進行測定。如圖2所示（以1月齡為例），通過峰面積積分值代入回歸方程，求得各氨基酸平均含量，結(jié)果如表2所示。

從表2可看出，隨月齡的增大，烏珠穆沁羊骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織中羥脯氨酸不斷增加，甘氨酸和脯氨酸含量有不斷減少的趨勢。通過SAS軟件的ANOVA方差分析對所測結(jié)果進行分析可知，Ⅲ型膠原蛋白中甘氨酸和脯氨酸在1月齡和3月齡之間差異不顯著（P>0.05），其他各月齡之間2種氨基酸含量差異顯著（P<0.05），且隨月齡增加，羥脯氨酸含量顯著增加（P<0.05）。

2.2.3 烏珠穆沁羊生長過程中Ⅲ型膠原蛋白含量的變化分析

同理計算Ⅲ型膠原蛋白含量。表2中的數(shù)據(jù)表示各月齡每單位濕質(zhì)量烏珠穆沁羊股二頭肌中Ⅲ型膠原蛋白含量的平均值和標準差。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)可知，隨月齡的增加，肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白的含量不斷增加。通過SAS軟件的ANOVA方差分析對所測結(jié)果進行分析可知，Ⅲ型膠原蛋白含量各月齡之間差異均顯著

（P<0.05），即烏珠穆沁羊肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白的含量隨月齡的增加而顯著增加（P<0.05）。

3 討 論

Ⅲ型膠原蛋白是構(gòu)成肌內(nèi)結(jié)締組織中肌內(nèi)膜和肌束膜的主要成分之一，它的含量與性質(zhì)對食肉嫩度和食肉加工特性有一定影響。Seideman等[17]報道，不同品系的牛和羊，由于它們的性成熟時間不同還會使品系和性別、年齡一起協(xié)同影響肌肉內(nèi)膠原蛋白的含量。此外，來自相同品系的牛和羊，同一肌肉的不同部位中膠原蛋白含量也存在差異。Lovell等[18]研究證明，哺乳動物Ⅲ型膠原蛋白的含量在其生長初期處于較高水平，但隨著動物生長期的不斷延長，由于膠原蛋白酶的作用使得Ⅲ型膠原蛋白部分被降解，從而導(dǎo)致Ⅲ型膠原蛋白的含量逐漸降低，而Ⅰ型膠原蛋白的含量逐漸升高。Ⅲ型膠原蛋白和Ⅰ型膠原蛋白分子的不同之處在于，Ⅲ型膠原蛋白分子之間含有二硫鍵，這個共價鍵在肉制品的加熱熟制過程中，由于熱收縮而引起成熟膠原蛋白穩(wěn)定性的增加，從而使肉的硬度增加。Mccormick[19]認為，隨著動物年齡的增長，膠原蛋白之間非還原性交聯(lián)的結(jié)構(gòu)增多，這就使得膠原蛋白更加穩(wěn)定，難以消化和水解，從而導(dǎo)致肌肉嫩度下降。李曉波[20]對不同月齡蘇尼特羊的不同部位的肌肉總膠原蛋白含量進行分析后表明，隨著月齡的增加，總膠原蛋白的含量呈增加的趨勢，同一月齡不同部位肌肉中總膠原蛋白含量也不同。本課題組已有研究也證明了烏珠穆沁羊隨著月齡的增加肌內(nèi)結(jié)締組織以及Ⅰ型膠原蛋白含量不斷增加[6-8]。肌肉中膠原蛋白含量的增加與肌肉組織本身的生長發(fā)育有同步的原因是因為隨著動物年齡的增加，膠原纖維的平均直徑及分子間的交聯(lián)程度不斷增加，肌肉中的膠原蛋白以量的增長為主，當達到一定年齡后，肌肉中的膠原蛋白則主要與分子間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。本實驗分析了烏珠穆沁羊隨月齡的增加肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅲ型膠原蛋白含量的變化規(guī)律，但對家畜肌內(nèi)結(jié)締組織中膠原蛋白共價交聯(lián)以及它的交聯(lián)程度對肉質(zhì)的作用還存在爭議，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

不同月齡烏珠穆沁羊肌內(nèi)結(jié)締組織Ⅲ型膠原蛋白在SDS-PAGE凝膠上得到清晰的分離，條帶中顯示出一條α（Ⅲ）肽鏈與一條β（Ⅲ）肽鏈，其中β（Ⅲ）肽鏈是α（Ⅲ）的二聚體；烏珠穆沁羊生長過程中，隨月齡的增大肌內(nèi)結(jié)締組織中甘氨酸和脯氨酸含量顯著下降（P<0.05），但在1月齡和3月齡之間差異不顯著

（P>0.05），其他各月齡之間2種氨基酸含量均差異顯著（P<0.05），且隨月齡增加，羥脯氨酸含量顯著增加（P<0.05）；膠原蛋白含量各月齡之間差異均顯著

（P<0.05），且隨月齡的增加而顯著增加（P<0.05）。

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