細胞穿透肽Tat—LK15介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性研究

饒 云 彭 捷 吳昊澎 曹仲文 陸建華 屠偉峰

摘 要：通過與Lipofectamine TM RNAiMAX（Lipo）比較，探討細胞穿透肽Tal-LK15對人腎上皮細胞（human enbryonic kidney 293T cells，293T）和大鼠視神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell ling，RGC-5）轉(zhuǎn)染小干擾RNA（smallinterfernce RNA，siRNA）的效率和細胞毒性，為后期實驗提供依據(jù)。以羧基熒光素（carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記的siRNA為報告基因，不同劑量的Tat-LK15 （Tat-LK15組）和Lipo（Lipo組）為轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染293T和RGC-5細胞轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡觀察FAM熒光強度，計算轉(zhuǎn)染效率，并以CCK-8法檢測細胞毒性。隨著Tat-LK15 和Lipo劑量的增加，siRNA轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。 當(dāng)Tat-LK15與siRNA配比為2：1（μg/μg）時，RGC-5細胞的轉(zhuǎn)染效率達到最高（（87.3±4.5）%），低于Lipo與siRNA配比為5：1（μL/μg）時的最高轉(zhuǎn)染效率（（96.2±3.2）%（P<0.05））；作用于293T細胞時，兩轉(zhuǎn)染試劑的最高轉(zhuǎn)染效率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>O.05）轉(zhuǎn)染試劑劑量增加，Lipo細胞毒性顯著增加，而TaI-LK15毒性無明顯變化。轉(zhuǎn)染效率最高時，Lipo（5μL）組293T和RGC-5的細胞荷活率僅為（（77.8±4.1）%，（73.4±7.7）%）顯著低于Tal-LK15 （2：1）組同種細胞的存活率（（91.0±3.7）%.（90.0±6.1）%）（P<0.05） Tat-LK15可有效地轉(zhuǎn)染siRNA，細胞毒性低，安全性突出.有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：細胞穿透肽（CPPs）：Tat-LK15；轉(zhuǎn)染試劑：小干擾RNA

中圖分類號：R318

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007—7847（2014）06一0505一06

RNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用，而轉(zhuǎn)染試劑作為其關(guān)鍵因素一直得到大量關(guān)注。常用的小干擾RNA （siRNA）轉(zhuǎn)染方法有病毒載體法、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法和陽離子聚合物法。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但其制備過程復(fù)雜、價格昂貴，免疫原性和生物安全性問題也限制了它的應(yīng)用。陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，亦可能干擾細胞代謝。動物實驗表明，在體使用陽離子脂質(zhì)體可誘發(fā)肺部炎癥，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重肺損傷。陽離子聚合物安全窗小，當(dāng)需要提高轉(zhuǎn)染效率而增加轉(zhuǎn)染試劑劑量時，會明顯增加其生物毒性。細胞穿透肽是一類由30個或更少氨基酸組成的富含堿性氨基酸、帶正電荷的短肽，可高效介導(dǎo)小分子（蛋白、肽、核酸等）進入不同類型的細胞而發(fā)揮生物活性。作為載體工具，細胞穿透肽在基因治療及新藥開發(fā)等領(lǐng)域具有很大的研究和應(yīng)用價值。

HIV-Tat是一段由人類免疫缺陷病毒I型基因編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子（transactivator oftranscription， Tat），具有細胞穿透肽活性，能將與之連接的核酸、多肽等以濃度依賴的方式高效快速地導(dǎo)入胞內(nèi)，且不影響細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能；具有轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。本實驗為提高Tat的轉(zhuǎn)染效率，選擇Tat蛋白中具有穿膜功能的核心氨基酸序列（49～57，RKKR-RQRRR）與膜活化蛋白LKI5 （KLLKLLLKLLLKL-LK）融合.合成序列為RKKRRQRRRCJGGKLLKL-LLKLLLKLLK的新型細胞穿透肽Tat-LK15。為研究Tat—LK15的轉(zhuǎn)染效果，本實驗擬以最常用的陽離子脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TMRN_AiMAX （Lipo）為對照，轉(zhuǎn)染羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的siRNA，通過熒光顯微鏡觀察Tat-LK15的轉(zhuǎn)染效率，并通過CCK-8法檢測其細胞毒性。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎上皮細胞（293T）和大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5（廣州萊德爾牛物科技有限公司）、FAM-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）、Tat-LK15（廈門博欣生物科技有限公司）、Lipofec-tamine TM RNAiMAX （Invitrogen，美國）、胎牛血清（Hyclone，美國）、DMEM-高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、DMEM -F12培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、Opti -MEM培養(yǎng)基（invilrogen，美國）、青鏈霉素（Hyclone，美國）、PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone，美國）、CCK-8溶液（碧云天，上海）、酶標(biāo)儀（Biocell，奧地利）、細胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、低速離心機（中佳，北京）、倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41，日本）、超凈工作臺（AIR TECH，日本）、倒置熒光顯微鏡（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

293T細胞使用DMEM -F12培養(yǎng)基（添加10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素）、RGC-5細胞使用DMEM-高糖培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素），置于含5%C02、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前l(fā) d，胰酶消化293T細胞、RGC-5細胞并計數(shù)，每孔lxl05接種于24孔培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日細胞密度為300/c～50%左右。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

細胞去完全培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，加250 μLOpti-MEM培養(yǎng)基準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。Opti-MEM培養(yǎng)基125 μL稀釋0.3 μg FAM-siRNA（終濃度50nmol/L）； Tat-LK15組：Opti-MEM培養(yǎng)基125 μL稀釋Tat-LK15，Tat-LKl5與siRNA的質(zhì)量比分別為1：2 .3：4、1：1、4：3、2：1 （μg/μg），Lipo組：Opti-MEM培養(yǎng)摹125μL稀釋Lipo，Lipo 與siRNA劑量比分別為1：1、2：1、3：1、4：1、5：1 （μL/μg）。siRNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液混合靜止20min后加到相心細胞培養(yǎng)板中，終培養(yǎng)基500μL；各實驗組設(shè)置4個復(fù)孔。4 h后吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，每孔加入500 μL完全培養(yǎng)基后置于5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染效率測定

轉(zhuǎn)染后24 h，倒置熒光顯微鏡檢測FAM顯色并拍照。倒置熒光顯微鏡計算轉(zhuǎn)染效率：每孔尋找3個代表性視野，各觀察100個細胞，計算陽性細胞率。普通視野下計得細胞數(shù)為N，相同視野換熒光下計得熒光細胞數(shù)為n轉(zhuǎn)染效率=n/N×100%。

1.2.4 CCK一8檢測細胞毒性

轉(zhuǎn)染后24 h將各孔細胞胰酶消化后分別吸出，每孔按l×10 4細胞接種至96孔培養(yǎng)板置于5%C02、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出96孔細胞板去日培養(yǎng)，用新鮮DMEM培養(yǎng)摹清洗2次，加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h：以未轉(zhuǎn)染細胞為對照孔，符組設(shè)置6個復(fù)孔，酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的吸光度（OD），并計算細胞存活率（細胞存活率=轉(zhuǎn)染組細胞（OD）對照組細胞0D×100%）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析（ANOVA）F檢驗對相關(guān)數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計處理，多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

隨著Tat-LK15和Lipo劑量增加轉(zhuǎn)染效率增高，但是增長趨勢減小。在Tat -LK15組，Tat -LK15與siRNA比例為4：3—2：1 （μg/μg）時，轉(zhuǎn)染效率達到最高，Tat-LK15/siRNA為4：3和2：1時兩交聯(lián)比的293T細胞的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異（P>0.05，見表1、圖1）；RGC-5細胞的轉(zhuǎn)染效率也無明顯差異（P>0.05，見表l、圖2）。Lipo與siRNA為5：1（μL/μg）時兩細胞的轉(zhuǎn)染效率達到最高。作用于293T細胞時，Tat-LK15（2：1）轉(zhuǎn)染效率為（93.1±3.0）%與Lipo （5：1）組（98.2±1.6）%差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，見表l、圖3、4）作用于RGC-5細胞時，Tat -LK15（2：1）組轉(zhuǎn)染效率（87.3±4.5）%低于Lipo （5：1）組（96.2±3.2）%（P<0.05.見表l、圖5、6）；但是與Lipo （4：1）組轉(zhuǎn)染效率為（90.1±4.2）%比較無顯著差異（P>0.05）。Tat-LK15對于介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染具有良好的轉(zhuǎn)染效率.（見表l、圖1～6）。

2.2 細胞毒性

兩種轉(zhuǎn)染試劑的細胞毒性隨劑量增加而增強，并呈劑量依賴性。Tat-LK15對293T和RGC-5細胞抑制率較小，轉(zhuǎn)染24 h后無明顯細胞毒性（圖7、8黑色柱）；Lipo對細胞具有一定毒性，隨劑量增加細胞仔活率明顯下降（圖7、8灰色柱）；作用于293T細胞時，TaI-LK15 （2：1）組轉(zhuǎn)染效率最高，細胞存活率為（91.0±3.7）%，Lipo（5：1）組轉(zhuǎn)染效率最高，細胞毒性也達到最大，細胞存活率為（77.8±4.1）%，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P

3 討論

脂質(zhì)體是目前使用最為廣泛的非病毒核酸轉(zhuǎn)染試劑，具有轉(zhuǎn)染效率高、可攜帶基因片段大、無免疫原性、可重復(fù)轉(zhuǎn)染等優(yōu)點。盡管如此，其細胞毒性和在體實驗組織損傷卻限制了其進一步應(yīng)用，開發(fā)更有效、毒性更小、不干擾細胞生理活動的非脂質(zhì)體載體已成當(dāng)務(wù)之急。

細胞穿透肽是一類具有穿透細胞膜功能的小分子多肽，可有效介導(dǎo)比其分子質(zhì)量大近100倍的外源性疏水大分子（蛋白、核酸等）進入細胞內(nèi)，而示見其對宿主細胞有明顯毒副作用。HIV -Tat蛋白則是現(xiàn)今研究最廣泛的細胞穿透肽之一，其主要機制可能包括：通過脂質(zhì)層的被動轉(zhuǎn)運，Tat上大量堿性氨基酸攜帶的正電荷與細胞表面的負電荷通過靜電作用轉(zhuǎn)運物質(zhì)；網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞；巨吞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞等。Tat蛋白結(jié)構(gòu)域堿性區(qū)中49～57位氨基酸（RKKRRQRRR），即蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 （protein transduction domain， PTD）是HIV-Tat 蛋白中一個富含堿性氨基酸的具有穿膜活性的最小多肽片段。Nagahara和Schwarze等分別證實了Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域離體和在體條件下都具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。由于單純Tat介導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)染效率不甚理想，為優(yōu)化Tal轉(zhuǎn)染核酸的效率，Eguchi等通過結(jié)合一個雙鏈RNA結(jié)合域（doublestrand RNA binding domain，DRBD）構(gòu)成PTD-DRBD融合蛋白，后者可以包裹siRNA 上帶負電荷的骨架，避免其沉淀聚集，從而顯著改善了Tat對siRNA的轉(zhuǎn)染效率，甚至于脂質(zhì)。 Saleh和Arthanari等則指出，Tat經(jīng)LK15 （KLLKLLLKL-LLKLLK）修飾構(gòu)成的Tat-LKl5 可高效地介導(dǎo)基因傳遞，而細胞毒性在其濃度為10μmol/L時.即使用劑量的50倍才開始出現(xiàn)。因此Tat-LKl5可能是一種轉(zhuǎn)染效率高細胞毒性小的良好siRNA載體工具。

本研究顯示Tat-LK15/siRNA對293細胞和RGC-5細胞具有良好的轉(zhuǎn)染效率，雖然略低于Lipo，但最高轉(zhuǎn)染效率也可達（93.1±3.0）%和（87.3±4.5）%，表明Tat轉(zhuǎn)染效率較高且具有轉(zhuǎn)染多種細胞的潛能，與相關(guān)文獻報道一致。Tat-LKl5/siRNA（μg/μg）在1：2—4：3時，轉(zhuǎn)染效率顯著增高；而4：3組與 2：1組的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異，表明在4：3時Tat-LKl5與siRNA交聯(lián)可能達到飽和Tat -LK15組細胞存活率最低分別為（91.0±3.7）%，和（90.0±6.1）%，未見明顯的細胞毒性，Lipo組siRNA轉(zhuǎn)染效率隨Lipo劑量增加而相應(yīng)增高，轉(zhuǎn)染效率可由40%升高至95%左右，而細胞毒性也顯著增強，細胞存活率由92%降至70%左右，由此可見，Tat-LKl5具有良好的核酸轉(zhuǎn)染效率，其生物安全性則表現(xiàn)得更為突出。

綜上所述，細胞穿透肽Tat-LK15具有良好的核酸轉(zhuǎn)染效率，且細胞毒性低，生物安全性好，是一種有一定應(yīng)用前景的非病毒核酸轉(zhuǎn)染載體，通過不斷改進和優(yōu)化其轉(zhuǎn)染方法及條件，可用于轉(zhuǎn)染siRNA沉默目的基因的相關(guān)研究。本實驗結(jié)果為后期應(yīng)用Tat-LK15介導(dǎo)基因治療提供了理論依據(jù)。