酵母表面展示T載體構建及目的蛋白的表面展示

梁秀怡 梁志成 朱 筱 劉詩雨 張 智 田生禮

摘 要：構建一種能對PCR產(chǎn)物進行直接克隆并展示于酵母表面的新型T載體。根據(jù)酵母表面展示載體pYD1多克隆位點序列設計出利用兩端帶有Xcm I內(nèi)切酶酶切位點的含有黃色熒光蛋白基因的Xcm I酶切盒，通過Nhe I和Xho I酶切位點插入到pYDl裁體上形成質(zhì)粒pYD-YFP，并對其進行酶切鑒定和DNA測序分析，再經(jīng)Xcm l酶切后形成兩端帶有dT的表面展示T載體。利用PCR擴增兩個含有熒光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed的基因并直接克隆到所構建的T載體中，檢測其表達功能。 酶切鑒定和DNA測序結果顯示PCAD-CFP和PSR-DsRed正確插入載體上，分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY100中，激光共聚焦顯微鏡下觀察到相應的熒光的酵母，表明克隆有融合蛋白基因片段的載體成功在酵母細胞中進行表面展示，證明了所構建的酵母表面展示T載體具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。

關鍵詞：T栽體：酵母表面展示；真核表達：Xcm I酶切盒

中圖分類號：Q782

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）（）6-（）477-06

酵母表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)成本低廉、便于大規(guī)模培養(yǎng)和培養(yǎng)周期短等特性，同時又具有真核生物的蛋白翻譯后修飾功能，近年來逐漸用于藥用和食用蛋白的生產(chǎn)。酵母表面展示技術（yeastsurface display system）在20世紀90年代初開始興起，是-種將外源蛋白質(zhì)進行固定化表達的真核展示系統(tǒng).廣泛應用于蛋白質(zhì)的相互作用、抗體研制、蛋白分子定向等領域，特別在生物乙醇生產(chǎn)過程中起到關鍵作用，包括淀粉酶、纖維素酶等酶蛋白均已進行表面展示。 a凝集素和α凝集素是錨定在細胞壁上的甘露糖蛋白，介導單倍體交配型（MATa）和（M ATα）的識別和粘附。最常見酵母表達系統(tǒng)為a凝集素展示系統(tǒng)和α凝集素展示系統(tǒng)，a凝集素由兩個亞單位Agalp和Aga2p組成，由于Agalp亞基通過與細胞壁上的β葡聚糖的共價連接而錨定在細胞壁，Aga2p和Agalp兩個亞基通過兩對二硫鍵相連，因此a展示系統(tǒng)是將a凝集素的Aga2p亞基與目的蛋白進行融合，在信號肽的引導下實現(xiàn)酵母的表面展示。α凝集素展示系統(tǒng)則將目的蛋白與α凝集素融合，從而將其展示于酵母細胞表而。其中酵母表而展示主要采用的宿主菌是釀酒酵母（Sacclzaromyces cerevisiae），已被FDA列為CRAS （Generally regarded as safe）原材料.釀酒酵母表面展示能夠把日的蛋白與凝集素功能結構域融合，將目的蛋白表達并定位于酵母細胞膜的表面，不但易于純化鑒定，并且酵母具有真核生物的翻譯后修飾體系，能表達具有一定活性的真核生物的蛋白。相比細胞內(nèi)表達的酶.酵母表面展示可多次生產(chǎn)展示于細胞表面的蛋白，并且在廉價的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可達到很高的細胞密度，適應工業(yè)生產(chǎn)需求，省去酶的純化和固定化等繁瑣步驟。

構建酵母表而展示載體是蛋白質(zhì)進行酵母表面展示的基礎，PCR產(chǎn)物克隆需耗費大量的時間與精力在表達載體的構建、質(zhì)粒的提取和重組子的鑒定上，而利用T載體可對PCR產(chǎn)物進行快速有效的克隆，因此有必要構建一個可直接對PCR產(chǎn)物進行克隆和表達的酵母表面展示T載體，特別是進行大量的PCR產(chǎn)物克隆時，可以極大減少實驗操作的步驟。

本文克服了常規(guī)構建表達載體操作繁瑣的缺點，以酵母表面展示載體pYDl為基礎，通過向載體pYDl插入含有黃色熒光蛋白基因的Xcm I酶切盒，再切除黃色熒光蛋白基因來構建酵母表面展示T載體，并利用熒光蛋白基因檢測該表面展示載體的克隆和表達功能。

1 材料與方法

1.1材料

1.l.l 菌株和載體

克隆載體pMD-18T購自日本Takara公司；pDsRedl-Nl、pEYFP-Cl、pECFP-Cl、pYD-l載體購自美國Invitrogen公司，大腸桿菌JM107和釀酒酵母EBY100由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑

Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購于日本rllakara公司；限制性核酸內(nèi)切酶Nhe I、Nde I、Xho I、BamH I、Xcm I為美國NEB（北京）公司產(chǎn)品；所有PCR反應的引物（表1）及測序均在北京華大基因公司合成。

1.2方法

1.2.1 Xcm I酶切盒的合成

以含有黃色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEYFP-Cl為模板，使用的引物pYDTl和pYDT2（表1），進行PCR擴增，擴增含有黃色熒光蛋白基因位點的Xcm I酶切盒，長度約760 bp，擴增程序為：預變性94℃ 5 min； 94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 10 min，進行30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行l(wèi)%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收后，通過T4 DNA連接酶連接至pMD-18T裁體，重組載體命名為pMD-YFP，并送往華大基因公司進行序列測定，分析克隆基因序列組成及其閱讀框架的正確性。

1.2.2 酵母表面展示T載體pYD-T的構建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶Xho 1和Nhe l酶切pMD-YFP后進行電泳，切膠回收切出的小片段，連接到經(jīng)由同樣的限制性內(nèi)切酶酶切pYDl質(zhì)粒上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pYD-YFP，質(zhì)粒及多克降位點序列圖譜見圖l。將pYD_YFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM107感受態(tài)細胞中，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落提取質(zhì)粒.對酶切鑒定正確的質(zhì)粒再進行DNA測序分析將DNA測序正確的pYD-YFP轉(zhuǎn)化至酵母EBY100感受態(tài)細胞，鋪于SD/Trp-平板上培養(yǎng)，挑取直徑為2～3 mm的酵母EBYIOO單菌落于于10 mL，酵母SD/Trp'液體培養(yǎng)基（含2%乳糖）中進行誘導表達.30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48～72 h。取誘導后的酵母菌液300μL，1 000 r/min離心5 min，去上清液，用lmL無菌水洗滌并重懸菌體，由于原載體pYD-PYDl是釀酒酵母表而展示載體、改造后的載體上插入帶有YFP基因的酶切盒片段，YFP蛋門通過錨定蛋白展示到酵母細胞壁上，因此在505 nm激發(fā)光下通過激光共聚焦顯微鏡可直接觀察到相應的熒光，證明了載體pYD-YFP的正確性。質(zhì)粒pYD-YFP經(jīng)Xcm I酶切后，回收載體部獲得酵母表而展示T載體。

1.2.3 酵母表面展示T載體pYD-T克隆目的基因

本文利用多頭絨泡菌（Physarum， poly-cephalun）的兩個蛋白肉桂醇脫氫酶PCAD （Gen-Bank登陸號：KF861979.1）和PSR蛋白（GenBank登陸號：FJ917746）對pYD-T的功能進行驗證。使用引物TCADP1、CAD-CFPP2和CFPP3通過重疊PCR將PCAD與青色熒光蛋白eCFP的兩個基因連接構成融合基岡PCAD- CFP。另外使用引物pSR -TPl .pSR -DsRedP2和DsRedP3通過重疊PCR將PSR和紅色熒光蛋門DsRed兩個基因連接構成融合基因PSR-DsRed，以上兩個融合基因基因片段3端均引入一個BamH I酶切位點。

將pYD-T載體用限制性內(nèi)切酶Xcm l酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收載體部分，得到兩端帶有突同T的線性化T載體，分別連接PCAD-CFP和P.SR-D.s Red，獲得的重紺載體分別命名為pYD-PSR-DsRed和pY D—PCAD一CFP，融合蛋白表面展示示意圖見圖2。將連接好的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM107感受態(tài)細胞中，涂板37℃培養(yǎng)過夜。挑取長勢良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進行酶節(jié)鑒定。

1.2.4 酵母表面展示T載體pYD-T表達功能驗證

將pYD -PSR-DsRed和pYD - PCAD一CFP重組載體分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細胞中，操作過程參見文獻，將菌液鋪于SD/Trp-培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)3 d，通過菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于酵母SD/Trp-液體培養(yǎng)基（含2%乳糖）中，30 ℃， 200 r/min培養(yǎng)48—72 h取適量的菌液在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 酵母表面展示T載體pYD-T載體的構建

將Xcm I酶切盒片段克隆到pMD-18T載體中形成重組載體pMD-YFP.用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I酶切鑒定，結果見圖3泳道1、2、3，酶切出的片段與Xcrn I酶切盒長度相近，約為760 bp。Xcm I酶切盒片段通過Nhe I和Xha I 位點插入酵母表而展示表達載體pYD-l中，得到載體pYD-YFP重組，酶切鑒定結果見圖3泳道4 ，5；圖3泳道6為重組載體pMD-YFP經(jīng)過Xcm I酶切出YFP皋因后，回收載體部分獲得酵母表面展示T載體pYD-T。DNA測序結果表明所構建的真核表達載體含有完整的黃色熒光蛋白位點及酶切盒，證明pYD-YFP載體構建成功。pYD-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY 100后經(jīng)SD誘導培養(yǎng)基誘導72 h后.在激光共聚焦顯微鏡下拍攝到的細胞表面展示的YFP蛋白，圖4中均能清晰看到酵母表面展示呈現(xiàn)為綠光，這是因為帶有黃色熒光蛋白基因的酵母在青光的激發(fā)下呈現(xiàn)兩種光的合成光.即為綠色，部分酵母表面的綠色呈光圈狀，這說明Xcm I酶切盒中黃色熒光蛋白YFP已經(jīng)在酵母細胞膜上展示。

2.2 酵母表面展示T載體pYD-T克隆功能的鑒定

目標基因片段用PCR擴增方法在5或3端引入一個與T載體的3或5端所對應相同的限制性內(nèi)切酶位點（該限制性內(nèi)切酶位點務必確保在PCR片段中或者在T載體有且僅有一個），本文在PCAD-CFP和PSR-DsRed基因片段3端引入一個BamH I酶切位點，與載體5端的BamH I酶切位點相對應.連接目的基因的PCR產(chǎn)物與T載體構成重組載體，利用所設的限制性內(nèi)切酶進行單酶切鑒定。本研究使用BamH I進行單酶切，如果能切出與目標基因長度大小相近的片段，即可鑒定為正向連接，若沒有切出相應大小的DNA片段，則是反向連接，因為實際上反向連接時應該切出約為20 bp左右的片段，由于片段太小電泳后兀法直接觀察到，圖5、6顯示BamH I酶切后得到與重疊PCR產(chǎn)物大小相近的條帶，表明CAD-CFP和PSR-DsRed均載體pYD-T正向連接，DNA測序結果同樣證明了重組載體pYD-CAD-CFP和pYD-PSR-DsRed構建正確。

2.3 酵母表面展示T載體pYD-T的展示功能驗證

將重組載體pYD-CAD-CFP和pYD- PSR -DsRed轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY100感受態(tài)細胞中，挑取單菌落后接種至在SD/Trp-液體培養(yǎng)基（含20乳糖）中，30 ℃中震蕩培養(yǎng)3d后在激光共聚焦顯微鏡下的觀察展示結果，分別用558nm和405nm激發(fā)光檢測，可以看到酵母的表面發(fā)出明亮的紅光、青光，見圖7、8結果顯示目標蛋白主要分布在酵母細胞的表面，形成明顯的青色或紅色光圈，證明CAD-CFP、PSR-DsRed融合蛋白已經(jīng)成功在酵母表而展示。

3 討論

近10年來，酵母表面工程技術在生物技術領域得到迅速發(fā)展，酵母表面展示系統(tǒng)不僅能展示單個亞單位蛋白，而且能展示異源寡聚體多亞單位蛋白，在展示高等哺乳動物蛋白天然構象方而具有其獨特的優(yōu)越性。 T載體廣泛應用于PCR產(chǎn)物克隆，目前商品化的T載體主要是克降型T載體，只能用于基因的克隆與保存，不能用于基因的表達。若要進行目的基因的表達，需另外將目的基因克隆至表達載體，過程中涉及轉(zhuǎn)化子的大量測序和鑒定操作。本研究利用可變內(nèi)切酶Xcm I，識別的序列為CCA （N5/N4） TGG，將識別序列第8位沒為T，酶切盒上包含兩個反向的Xcm l酶切位點，經(jīng)Xcm I酶切后可產(chǎn)生3'帶有一個突出dT的T載體。兩個Xcm I位點之問包含黃色熒光蛋白基因，目的在于通過轉(zhuǎn)化測定菌體的熒光來檢測Xcm I的酶切效率，從而提高所制備T載體的質(zhì)量。PCR產(chǎn)物可以無需酶切、純化，減少篩選有效重組子的過程，通過TA克隆，直接連接到pYD-T載體構成重組載體，無需另外將目的基因重組至表達載體，直接進行蛋白在釀酒酵母表面展示（圖7、8），節(jié)省寶貴的研究時間和經(jīng)費，通過克降和表達功能的鑒定后證明此方法新穎可行：

目的基因在構建表達載體時，一般通過雙酶切法將目的基因克隆到表達載體，因此需要考慮目的基因上是否含有載體多克隆位點的酶切識別位點。通過酶切位點插入到載體上的過程中應避免使用目的基因上已有的酶切識別位點。本文在研究融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed在酵母表面的展示過程中，發(fā)現(xiàn)載體上的多克隆位點均出現(xiàn)目的基因上，難以通過傳統(tǒng)雙酶切法克隆至表面展示載體pYDl上，文中通過對pYDl載體進行改造后制備出T載體，除了內(nèi)切酶Xcm I外，無需考慮載體與目的基因上的其他酶切位點，重組的過程不需要考慮使用何種相應的限制性內(nèi)切酶，極大降低目的基因序列中含有與載體多克隆位點所用限制性內(nèi)切酶沖突的可能。通過TA可以連接，成功將目的基因克隆到載體pYD-T上，一步構建表達載體。若使用高保真Taq酶擴增，PCR產(chǎn)物不具有dA粘性末端，可再使用Taq酶進行擴增，使得PCR產(chǎn)物3'端帶有dA，這樣既可減少PCR過程中的錯配率，也可提高PCR產(chǎn)物與載體的連接效率。

本文所構建的酵母表面展示T載體具有操作簡便.快捷高效的特點，使具有藥用和工業(yè)應用價值的蛋白能夠更簡捷地進行酵母表面展示，為促進更多蛋白在酵母細胞表面的展示和酶的固定化研究建立了表達平臺。