一種簡易安全的從農(nóng)桿菌和酵母中提取RNA的方法研究

代麗娟　鄭唐春　臧麗娜　曲冠證

摘要[目的]設(shè)計一種簡易安全的從農(nóng)桿菌和酵母中提取RNA的方法。[方法]利用Triton X-100和SDS作為裂解液的主要成分，通過熱激法裂解菌體，然后進(jìn)行一系列的抽提、沉淀、洗滌，獲得純凈的RNA；并用瓊脂糖凝膠電泳及核酸檢測儀檢測總RNA的純度、濃度及質(zhì)量。[結(jié)果]該方法能高效裂解菌體，有效防止RNase污染，可以獲得高質(zhì)量的RNA。[結(jié)論]該研究成功的得到一種簡易、安全提取農(nóng)桿菌和酵母RNA的方法，為后續(xù)的基因表達(dá)分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞農(nóng)桿菌；酵母；RNA；提取方法

中圖分類號S182文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）07-01908-02

收稿日期20140212通過基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系一般稱為“工程菌”。常用的工程菌有大腸桿菌（Escherichia coli）、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。自從科學(xué)家發(fā)現(xiàn)根瘤農(nóng)桿菌能夠侵染植物后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法促使植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了快速發(fā)展[1-2]。酵母作為高等真核生物，是人類基因組研究的模式生物，在連鎖分析和定位克隆方面為人類遺傳性疾病研究提供了豐富的信息[3]。RNase不僅廣泛存在且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分離得到的RNA很容易被講解，因此RNA的分離已經(jīng)成為分子生物學(xué)的技術(shù)之一[4-7]。為了在分子水平上研究生物個體的基因功能，提取純度高、質(zhì)量好的RNA是工作基礎(chǔ)。目前，RNA的提取已經(jīng)有大量報道，主要針對動物、植物和特定的細(xì)菌等[8-9]。其中的一些方法不僅操作繁瑣，試劑毒性較大，而且提取效果并不是非常的理想。筆者利用一種操作簡單、試劑低毒的方法裂解并分離RNA，以期獲得高質(zhì)量的RNA，用于后期的PCR擴(kuò)增和northern blot等試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae INVSC1），由實驗室培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑。LB培養(yǎng)基（1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH 7.0），YPD培養(yǎng)基（1% Yeast extract，2% Peptone，2% Dextrose，pH 7.0），裂解液（2% Triton X-100，2% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）、三氯甲烷、無水乙醇、RNase-Free ddH2O、TAE、EB和瓊脂糖等，均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2方法

1.2.1 RNA的提取。①將農(nóng)桿菌和酵母單克隆菌落，在無菌操作下，分別接入3 ml的LB和YPD培養(yǎng)基，在28 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，吸取1.0 ml的培養(yǎng)液，于10 000 g下離心2 min，棄上清，收集菌體；②向菌體中加入300 μl的裂解液，渦旋振蕩30 s，徹底重懸菌體，將含有重懸菌體的離心管，放入液氮中冰凍2 min，然后轉(zhuǎn)入95 ℃水浴鍋中熱激2 min，重復(fù)上述冰凍-熱激2次，最后強(qiáng)力渦旋振蕩1 min；③向離心管中加入等體積的三氯甲烷，充分渦旋振蕩1 min，然后室溫下在20 000 g離心5 min；④轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，溫柔混合樣品，室溫靜置5 min，（可選）放置于-20 ℃下1 h以上可以增加RNA的產(chǎn)量；⑤室溫下，在20 000 g離心10 min；⑥吸取上清，用濃度70%的乙醇清洗沉淀2次；用離心機(jī)快速離心10 s，吸凈殘余液體，室溫晾干；⑦用30～50 μl RNase-Free ddH2O重懸沉淀。

1.2.2 RNA質(zhì)量的檢測。①瓊脂糖凝膠電泳檢測。分別取RNA 樣品1.0 μl，在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，110 V恒壓，20 min。紫外燈下觀察RNA 的條帶，并照相記錄結(jié)果。②RNA 的產(chǎn)量和純度檢測。各取1 μl RNA樣品，用NanoDrop 2000c核酸濃度測定儀分別測量OD260/280、OD260/230值以及RNA 的濃度（ng/μl）。

1.2.3 RNA的純化與濃縮。如果提取的RNA含有微量的DNA污染或者濃度較低，可以加入適當(dāng)?shù)腄Nase I消化后，將獲得的RNA進(jìn)行純化濃縮。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是總RNA完整性檢驗的常規(guī)方法，檢測時通過設(shè)置高壓快速電泳，在較短的時間內(nèi)，使RNA樣品中的23S、16S明顯的區(qū)分開來。為了保證RNA不被電泳槽內(nèi)的RNase降解，跑膠前應(yīng)清洗電泳槽，更換新鮮預(yù)冷的TAE緩沖液，這樣可以獲得更真實的RNA情況。圖1表明，所提取的農(nóng)桿菌和酵母菌總RNA中23S、16S能區(qū)分為2條帶，未發(fā)生拖尾等現(xiàn)象。而且大部分樣品的5S RNA也比較清晰，說明提取的樣品RNA沒有發(fā)生降解，完整性較好。

注：M為DNA marker DL5000；泳帶1～3為農(nóng)桿菌總RNA；泳帶4～6為酵母菌總RNA。

圖1農(nóng)桿菌和酵母菌總RNA的電泳圖譜2.2總RNA樣品的純度分析 將所提取的總RNA經(jīng)NanoDrop 2000c核酸濃度測定儀檢測其230、260、280 nm的吸光度值并計算OD260/280、OD260/230的比值。由表1可知，280 nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA的OD260/280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。該方法提取的總RNA的OD260/280的值在1.783～1.921，接近于2.0，說明樣品中殘余的蛋白等污染物較少。230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA和RNA的OD260/230比值為2.5。若比值小于2.0，表明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。結(jié)果顯示，該方法提取的總RNA的OD260/230的比值幾乎均大于2.0，說明樣品中可能還參與少量的鹽類或有機(jī)溶劑。