巴西橡膠樹HbCZF1的原核表達(dá)分析

易紅艷等

摘 要 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）是天然橡膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，在先前的研究中本課題組已克隆了與Hmgr1啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子基因HbCZF1。本研究在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了HbCZF1的原核表達(dá)載體PET-28a（+）-HbCZF1，將其轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta（DE3）菌株。經(jīng)優(yōu)化條件后，在20 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的條件下，獲得了分子量約47 ku的HbCZF1融合蛋白。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbCZF1基因；原核表達(dá)；蛋白純化

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase（HMGR）is involved in the biosynthesis of rubber. We cloned HbCZF1 which is interaction with the HbHMGR promoter in Hevea brasilensis. In order to study the function of HbCZF1， an HbCZF1 prokaryotic expression vector was successfully constructed. The pET-28a（+）-HbCZF1 construction was transferred into E. coli Rosetta（DE3）. Recombinant protein was expressed in abundance in E. coli Rosetta（DE3）after being induced by 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours at 20 ℃. The molecular mass of the recombinant protein is about 47 ku. The result laid a foundation for the further preparation of the HbCZF1 transcription factor antibodies and the analysis of interactions between the HbCZF1 and the HbHMGR promoter.

Key words Hevea brasiliensis； HbCZF1； Prokaryotic expression； Protein purification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.014

鋅指蛋白是真核生物基因組中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、成熟等生命過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。在鋅指蛋白家族中，CCCH型鋅指蛋白僅占所有鋅指蛋白的約0.8%[4-5]。目前的研究結(jié)果表明：CCCH型鋅指蛋白在植物中的主要作用是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物的脅迫反應(yīng)[6-10]，如Sun等[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSZF1和AtSZF2可負(fù)調(diào)控鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，Kong等[12]發(fā)現(xiàn)在水稻中過量表達(dá)CCCH型鋅指蛋白基因OsDOS可以延緩水稻葉片的衰老等。

巴西橡膠樹是一種重要的熱帶產(chǎn)膠植物，是天然橡膠主要的商業(yè)來(lái)源，在世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展中一直占有重要的地位。天然橡膠在橡膠樹的乳管內(nèi)合成，以膠乳（乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)）的形式貯存[13]。橡膠生物合成是一種典型的植物甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）代謝途徑[13]。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）在MVA代謝途徑中不可逆地催化HMG-CoA形成甲羥戊酸，繼而合成橡膠前體物質(zhì)，是MVA途徑的第1個(gè)限制酶， 也是天然橡膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[13-20]。橡膠樹HMGR是由3個(gè)基因Hmgr1、Hmgr2和Hmgr3組成的基因家族編碼的。根據(jù)3個(gè)基因在組織中的表達(dá)特性，Chye等[21-22]認(rèn)為Hmgr1可能與橡膠生物合成有關(guān)。張福城等[23]克隆了Hmgr1基因的啟動(dòng)子，并對(duì)順式作用元件進(jìn)行了分析。劉陳[24]利用酵母單雜交篩選到調(diào)控Hmgr1的CCCH型鋅指蛋白類的轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1，但Hmgr1與轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1之間的調(diào)控關(guān)系還不清楚。為了進(jìn)一步研究Hmgr1與轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1之間調(diào)控關(guān)系，本研究構(gòu)建了HbCZF1原核表達(dá)載體并進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了HbCZF1的融合蛋白，為下一步制備抗體、凝膠遷移（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等深入研究Hmgr1與轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1之間的調(diào)控關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

含有HbCZF1基因的質(zhì)粒、原核表達(dá)載體pET-28a（+）、E. coli DH10B 菌株、E. coli Rosetta （DE3）菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；Adevantage 2 PCR Kit 為Clontech公司的產(chǎn)品；pMD19-T Simple Vector試劑盒、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司的產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒、DNA marker、過硫酸銨、異丙基-β，D-硫代半乳糖苷（IPTG）、抗生素等均為中科瑞泰提供；Ni-NTA親和層析純化柱購(gòu)于MACHEREY-NAGEL；各限制性內(nèi)切酶、Protein marker為Fermentas公司的產(chǎn)品；HIS Tag羊抗兔抗體、二抗及Western-blot試劑盒為博士德公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的HbCZF1基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物6PCZF1F/ 6PCZF1R，并在引物兩端加上酶切位點(diǎn)BamHⅠ/XhoⅠ（酶切位點(diǎn)下劃線表示），其序列為：6PCZF1F（5′-ACGGATCCATGAATCCATTGACGCTGGT-3′）；6PCZF1R（5′-GACTCGAGTCATCTCTCTGATTTGCG

CC-3′），引物的合成由北京諾賽生物技術(shù)公司完成。

1.2.2 pET-28a（+）-HbCZF1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以橡膠樹HbCZF1基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：首先在95 ℃ 2 min，然后在95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增得到的目的片段純化后連接到 pMD19-T Simple Vector上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH10B，在含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR后，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序，并對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ/XhoⅠ的雙酶切鑒定。將線性pET28a（+）載體片段和目的基因片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH10B，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。選取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 HbCZF1基因的原核表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組表達(dá)載體pET-28a（+）-HbCZF1和pET-28a（+）的空載體分別轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta（DE3）菌株，挑取單菌落接種于5 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按1 ∶ 100的比例吸取菌液接種于20 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5～0.8后，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE來(lái)觀察重組蛋白是否表達(dá)。然后分別以不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為0.1、0.3、0.5、1 mmol/L）和不同的誘導(dǎo)時(shí)間（1、2、3、4 h）進(jìn)行誘導(dǎo)，將所取的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE分析。確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間和 IPTG濃度后，在20 ℃和37 ℃條件下分別進(jìn)行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃條件下離心收集菌體，每100 mL培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4 mL含蛋白酶抑制劑PMSF的結(jié)合緩沖液（pH=7.8，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl）中，用超聲波破碎儀破碎菌體，離心后分別取上清和沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確定最佳的誘導(dǎo)條件。

1.2.4 重組蛋白的純化及鑒定 收集菌體，每100 mL培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4 mL含有蛋白酶抑制劑PMSF的結(jié)合緩沖液（pH=7.8）中，超聲波破碎至菌液澄清，離心后收集上清，將收集的上清過Ni-NTA層析柱并洗脫下來(lái)，即可得到純化的重組蛋白。該蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，用羊抗兔HIS標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western-blot鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCZF1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物，以HbCZF1基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增到1條特異性條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果表明，該條帶大小為1 110 bp，且其序列與已知序列一致，并無(wú)錯(cuò)配堿基的出現(xiàn)。

將純化的目的條帶克隆到pMD19-T Simple載體上，選取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定，并將其命名為pMD19-T-HbCZF1。質(zhì)粒pMD19-T-HbCZF1經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，凝膠電泳分析可見2 500 bp左右大小的載體片段條帶與1 110 bp左右大小的目的片段（圖2）， 表明目的片段成功克隆到pMD19-T Simple載體上。

pMD19-T-HbCZF1重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后回收HbCZF1基因片段，與同樣經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-28a（+）連接，轉(zhuǎn)化篩選后得到重組質(zhì)粒，并將其命名為pET-28a（+）-HbCZF1。同時(shí)，選取重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與對(duì)應(yīng)序列一致。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-HbCZF1進(jìn)行雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可見約5 400 bp大小的載體片段與1 110 bp大小的目的基因片段（圖3），表明目的基因片段已經(jīng)插入到pET-28a（+）表達(dá)載體中。

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

在37 ℃下，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：pET-28a（+）-HbCZF1樣品中有分子量47 ku左右的特異表達(dá)蛋白條帶，而pET-28a（+）的樣品則沒有（圖4-A），這與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。在37 ℃下，以不同濃度的IPTG誘導(dǎo)4 h后，均有目的重組蛋白表達(dá)，幾個(gè)測(cè)試的IPTG濃度對(duì)表達(dá)的蛋白量影響無(wú)明顯差異（圖4-B），因此選取IPTG濃度為0.1 mmol/L進(jìn)行下一步的研究。在37 ℃和IPTG濃度為0.1 mmol/L條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，重組蛋白的表達(dá)量隨之增加（圖4-C）。誘導(dǎo)結(jié)束，超聲波破碎菌體處理后，沉淀中含有重組蛋白，上清中亦有不少重組蛋白的存在。這說明該重組蛋白有可溶性的表達(dá)。在相同誘導(dǎo)時(shí)間（4 h）內(nèi)，0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時(shí)上清中含有的重組蛋白最多（圖4-D）。因此，初步確定終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h是重組蛋白適合的表達(dá)條件。

在確定了的最適IPTG濃度和表達(dá)時(shí)間條件下，對(duì)誘導(dǎo)的溫度進(jìn)行比較。電泳結(jié)果表明：20 ℃和37 ℃的誘導(dǎo)條件下都有大量目的蛋白表達(dá)（圖5）。經(jīng)超聲波破碎處理，誘導(dǎo)下20 ℃目的蛋白上清中的蛋白含量相較于37 ℃有微量的增加，但并不顯著（圖5）。即與37 ℃誘導(dǎo)條件相比，溫度降低后可溶性蛋白含量并沒有明顯增加，故用 20 ℃或37 ℃誘導(dǎo)均可。

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

20 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，用Ni-NTA柱純化蛋白后SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：純化所得的蛋白分子量亦約為47 ku（圖6-A），這與未純化的融合蛋白大小一致，可推測(cè)該純化的蛋白即為目的蛋白。Western-blot的檢測(cè)結(jié)果表明：該純化的蛋白帶有HIS標(biāo)簽（圖6-B），即可知純化得到的目的蛋白就是HbCZF1蛋白，可用作抗原制備多克隆抗體或進(jìn)行EMSA。

3 討論

目前對(duì)橡膠樹中HMGR的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不了解，為了深入研究HMGR的表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，本研究室利用酵母單雜技術(shù)篩選調(diào)控HMGR的轉(zhuǎn)錄因子，并已獲得與Hmgr1啟動(dòng)子互作的CCCH型轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1。HbCZF1是橡膠樹中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CCCH型鋅指蛋白，為了進(jìn)一步研究HbCZF1的功能及其與Hmgr1啟動(dòng)子的調(diào)控關(guān)系，筆者對(duì)HbCZF1進(jìn)行了原核表達(dá)分析。

原核表達(dá)系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的一種表達(dá)系統(tǒng)，通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白，其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，且所需的成本相對(duì)比較低廉[25]。但同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)還存在如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難等缺點(diǎn)[26]。因此選擇原核表達(dá)系統(tǒng)必須對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。在對(duì)HbCZF1進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，曾構(gòu)建了4種重組表達(dá)載體pET-28a（+）-HbCZF1、pGEX6P-1-HbCZF1分別轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E. coli Rosetta（DE3）中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGEX6P-1-HbCZF1沒有獲得表達(dá)，究其原因還需探討。在優(yōu)化pET-28a（+）-HbCZF1在E. coli Rosetta（DE3）菌株中的表達(dá)條件中，采用適當(dāng)?shù)腎PTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間、溫度，盡量減少了過量表達(dá)對(duì)細(xì)胞的毒害作用，故得到了表達(dá)量較高的可溶性融合蛋白，并進(jìn)一步獲得了純化的目的蛋白。HbCZF1的原核表達(dá)的研究為下一步制作單克隆抗體，利用EMSA等進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子HbCZF1的功能奠定了基礎(chǔ)。

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