水稻OsPIN1a基因體外表達(dá)及蛋白磷酸化活性位點(diǎn)分析

王尉等

摘 要 輸出載體OsPIN1a是水稻PIN-FORMED（PIN）的家族成員之一，參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素在植物組織中的不均衡分布。然而，OsPIN1a蛋白的功能結(jié)構(gòu)域如何調(diào)節(jié)激素的極性運(yùn)輸仍需進(jìn)一步探討。本研究擬以日本晴水稻為材料，利用OsPIN1a基因的非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，特異地克隆目的基因，并借助Quickchange XL site-directed mutagenesis技術(shù)分別構(gòu)建單突變[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）和pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]及雙突變[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala和Ser254/Ala）]表達(dá)載體，通過(guò)體外蛋白表達(dá)和磷酸化活性分析，明確了OsPIN1a蛋白水解結(jié)構(gòu)域中Ser-233和Ser-254是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PINOID，PID）的磷酸化活性位點(diǎn)，此結(jié)果為進(jìn)一步研究生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞 水稻；OsPIN1a；蛋白表達(dá)；磷酸化

中圖分類號(hào) S511；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Expression in vitro of OsPIN1a Gene and

Analysis of Phosphorylation Sites

WANG Wei1，2， GUO Ning1， XU Mingzhao1， TIAN Haiyan2， SHI Shengyou2*

1 School of Life Sciences， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China

2 South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract As one of PIN-FORMED（PIN）efflux carriers， OsPIN1a is involved in regulating auxin distributions in plant tissues. However， how these functional sites of OsPIN1a regulate hormone distribution still need to be further analyzed. In our study， OsPIN1a gene was isolated from Oryza sativa L. cv. Nipponbare using the specific primers， designed according to untranslated regions. To explore the phosphorylation sites of OsPIN1a in proteolytic structures， the expression vectors of single mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala） and pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]and double mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala and Ser254/Ala）]were constructed by quickchange XL site-directed mutagenesis technique， respectively. OsPIN1a was expressed and analyzed by the expression system in vitro. Two phosphorylation sites of Ser-233 and Ser-254 can be phosphorylated by a serine-threonine protein kinase（PINOID， PID）. The results provide a reference for further studying the mechanism of auxin polar transport.

Key words Rice；OsPIN1a；Protein expression；Phosphorylation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.014

高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到植物激素的精確調(diào)控。生長(zhǎng)素在莖尖、幼葉和根等組織器官中合成后，通過(guò)輸出載體（PIN-FORMED，PIN）、輸入載體（AUXIN RESISTANT1/LIKE AUX1，AUX1/LAX）及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（P-GLYCOPROTEIN，PGP/ABCB）極性運(yùn)輸?shù)街仓甑牟煌课籟1-5]，不僅參與了植物的生理代謝過(guò)程，而且與根的向光性密切相關(guān)[6-7]。

擬南芥AtPIN家族包含8個(gè)PIN基因，AtPIN1、2、3、4、7屬于膜蛋白，而AtPIN5、6、8位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這些蛋白可與AUX1及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)同作用調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，導(dǎo)致激素在組織中的不均衡分布，影響根的伸長(zhǎng)和向地性等特性[8-9]。在水稻中，至少存在12個(gè)編碼OsPIN家族基因（OsPIN1a-d、2、5a-c、 8、 9、 10a-b）， 分別位于不同的染色體上[4]。OsPIN蛋白包含兩個(gè)疏水區(qū)（功能結(jié)構(gòu)域）和一個(gè)親水區(qū)，且每個(gè)疏水區(qū)有5次跨膜折疊[10]。然而，多基因家族的單個(gè)基因突變并不易引起植物形態(tài)的改變或功能的缺陷，尤其是水稻的OsPIN1包括a、b、c、d 等4個(gè)同源蛋白，具有較高的同源性，僅有幾個(gè)氨基酸的差異性[4]。因此，特異地分離同源基因，對(duì)明確其各自的功能顯得尤為重要。

研究表明，PIN蛋白可逆的磷酸化活性對(duì)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸起著關(guān)鍵作用，而這一過(guò)程需要絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PINOID（PID）和PP2A磷酸化酶的共同參與[11]。蛋白激酶抑制劑可阻礙擬南芥AtPIN1中TPRXS（N/S）結(jié)構(gòu)域磷酸化位點(diǎn)的活性，進(jìn)而影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸[12-13]。為探討水稻OsPIN1a蛋白如何調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)OsPIN1a克隆、體外蛋白表達(dá)及功能活性位點(diǎn)分析，明確了OsPIN1a親水區(qū)的磷酸化位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將在濕潤(rùn)濾紙上萌發(fā)后的水稻（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）秧苗移置在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（30 ℃，16 h光/8 h黑暗）。兩周后，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的植株材料置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 水稻植株總RNA的分離與cDNA合成 用RNAiso Plus（Takara）提取水稻植株中的總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)用于檢測(cè)RNA的質(zhì)量。一鏈cDNA的合成參照PrimeScript Reverse Transcriptase（TaKaRa）使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 OsPIN1a引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中所報(bào)道的水稻OsPIN1a基因（GenBank登錄號(hào)為BR000827）兩端非編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物（上游引物：GAAGTCGTGGTTTTCTTGGCTGC，

下游引物：GCAAACATGACGACCCTCACCT），以高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara）進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，2×GC buffer 25 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。將上述PCR產(chǎn)物回收并連入pMD18-T載體（TaKaRa）中，通過(guò)藍(lán)白斑和酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，后進(jìn)行測(cè)序鑒定目的片段的正確性。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pMD18-OsPIN1a為模板，分別用含有NdeI和XhoI的上下游引物特異性擴(kuò)增OsPIN1a序列（上游引物：GTCATATGGTGCAGA

TCGTGGTGCTCCAGTG，下游引物：GCCTCGAGTC

ACAGCCCCAGCAGGATG TAGT），后將目的片段連入pET-30表達(dá)載體。Quickchange XL site-directed mutagenesis（Stratagene）用于OsPIN1a中Ser-233和Ser-254突變載體構(gòu)建，具體操作步驟依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)及蛋白純化 將pET30-OsPIN1a、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala，Ser254/Ala）和pET-30空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌（BL21）中。選擇單克隆在5 mL的LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素，50 μg/mL），37 ℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；后取2 mL菌液在400 mL LB液體培養(yǎng)液（卡那霉素，50 μg/mL）中放大培養(yǎng)至OD約為0.5，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，18 ℃誘導(dǎo)24 h。通過(guò)鎳柱親和層析的方法純化重組蛋白，具體步驟依據(jù)Qiagen公司的蛋白純化手冊(cè)進(jìn)行。

1.2.5 Western blot和重組蛋白體外磷酸化分析 Western blot依據(jù)Welinder等[14]所描述的方法操作。帶有His標(biāo)簽的PID激酶和純化的重組蛋白用于體外磷酸化分析[11，13]。將1 μg上述兩種蛋白混勻后加入ATP溶液（100 mmol/L MgCl2/ATP和1 μ Ci [γ-32P]ATP）和激酶反應(yīng)混合液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L DTT和5 mmol/L MgCl2）置于30 ℃反應(yīng)40 min，后煮沸5 min終止反應(yīng)。10%的聚丙烯酰胺凝膠用于分離重組蛋白，蛋白膜被密封在塑料的器皿中，置于-20 ℃下曝光24～48 h。P32放射自顯影信號(hào)強(qiáng)度與考馬斯染色結(jié)果的比值用于表示蛋白的磷酸化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPIN1a基因克隆及分析

依據(jù)OsPIN1a基因非編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物，分別以水稻DNA和RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果如圖1所示，在不同的核酸水平上均特異地?cái)U(kuò)增出一目的條帶，與Genbank中已登錄的序列大小相符。為進(jìn)一步驗(yàn)證所得序列的正確性，將上述PCR產(chǎn)物回收并連入T載體中進(jìn)行測(cè)序，所得核苷酸序列與OsPIN1a（GenBank登錄號(hào)為BR000827）具有99.7%的同源性，個(gè)別堿基的差異性可能是測(cè)序或PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的誤差。同源比對(duì)和在線預(yù)測(cè)（NetPhos program）發(fā)現(xiàn)OsPIN1a-d蛋白序列中均含有擬南芥AtPIN1類似PID磷酸化的保守結(jié)構(gòu)域TPRXS（N/S）。

2.2 OsPIN1a體外表達(dá)及蛋白純化

鎳柱親和層析對(duì)體外表達(dá)的OsPIN1a蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖2所示，在約65 ku（含有6個(gè)組氨酸）處有一條純化的蛋白條帶。用His抗體對(duì)OsPIN1a基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，1泳道空質(zhì)粒表達(dá)的蛋白65 ku處無(wú)任何免疫信號(hào)；而pET30-OsPIN1a表達(dá)（2泳道）和純化（3泳道）的蛋白均具有較強(qiáng)的免疫信號(hào)。由此表明，OsPIN1a蛋白已在大腸桿菌中成功表達(dá)。

2.3 OsPIN1a蛋白PID磷酸化位點(diǎn)分析

將OsPIN1a的TPRXS（N/S）結(jié)構(gòu)域中預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)Ser-233和Ser-254分別用Ala替代，對(duì)單突變及雙突變基因進(jìn)行體外表達(dá)和純化，并與PID激酶互作進(jìn)行磷酸化活性分析。結(jié)果如圖3所示，泳道1中完整的OsPIN1a蛋白具有較強(qiáng)的磷酸化信號(hào)，當(dāng)233位點(diǎn)的Ser突變?yōu)锳la時(shí)，放射自顯影信號(hào)明顯降低（泳道2）；類似地，254位點(diǎn)的Ser也可被PID激酶磷酸化（泳道3）；如將上述兩位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，P32信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步減弱（泳道4）。

3 討論與結(jié)論

水稻OsPIN1類型的蛋白（OsPIN1a-d）具有較高的同源性，這給單基因分離和功能分析增加了困難。考慮到OsPIN1a-d組織器官表達(dá)差異性可能與基因特異的非編碼調(diào)控區(qū)相關(guān)[4-5]。至此，本研究選取OsPIN1a基因3′和5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物特異地分離了目的基因。由于序列內(nèi)部引物較難分辨不同的OsPIN1a-d基因，故用啟動(dòng)子結(jié)合相應(yīng)的報(bào)告基因（GUS或GFP等）研究其組織定位和基因表達(dá)特征將更優(yōu)于RT-PCR。

光作為重要的環(huán)境信號(hào)影響著根的負(fù)向光性與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸。王忠等[15]和Xu等[16]研究表明，水稻根負(fù)向光性與OsPIN1a調(diào)控根冠的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸形式密切相關(guān)。然而，OsPIN1a通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮運(yùn)輸活性仍需進(jìn)一步明確。擬南芥的AtPIN1親水性區(qū)域TPRXS（N/S）含有多個(gè)絲氨酸（如：Ser-337）和蘇氨酸（如：Thr-340）磷酸化活性位點(diǎn)[11，17-18]，磷酸化位點(diǎn)突變后的AtPIN1最終定位于根尖的表皮基部，而具有磷酸化活性的AtPIN1則位于頂部。上述結(jié)果與PID激酶缺失突變體所表現(xiàn)的特性是類似的[19]，這表明PID激酶可能通過(guò)調(diào)節(jié)AtPIN1的磷酸化活性，進(jìn)而影響蛋白在細(xì)胞中的定位。

TPRXS（N/S）作為PIN蛋白親水性區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于不同植物中[13]。擬南芥的PID激酶在體外可使TPRXS（N/S）結(jié)構(gòu)域中的Ser磷酸化，影響AtPIN1蛋白在組織中的定位和植株的生長(zhǎng)發(fā)育[13]。本研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)水稻OsPIN1、OsPIN2和OsPIN10蛋白中均含有TPRXS（N/S）結(jié)構(gòu)域，PID激酶也可使OsPIN1a蛋白保守結(jié)構(gòu)域中Ser（233和254位點(diǎn)）發(fā)生體外磷酸化（圖3），這表明不同植物同一類型的PIN蛋白可能具有類似的磷酸化激活機(jī)制[20]。盡管水稻OsPIN1a中的233和254兩個(gè)Ser活性位點(diǎn)被突變，但仍具有部分磷酸化信號(hào)強(qiáng)度，這與AtPIN1a蛋白體外磷酸化研究結(jié)果是一致的[15]，猜測(cè)可能OsPIN1a蛋白中含有其它的PID激酶磷酸化位點(diǎn)。而水稻OsPIN5、OsPIN8和OsPIN9蛋白相同位點(diǎn)缺少類似的TPRXS（N/S）結(jié)構(gòu)域，這是由于不同類型的PIN具有不同的激活機(jī)制，在調(diào)節(jié)激素運(yùn)輸過(guò)程中具有不同的功能。然而，OsPIN家族不同成員之間如何協(xié)同作用調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，仍需進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：凌青根