響應面法優(yōu)化黑木耳酸性多糖硫酸酯化制備工藝

尹紅力 佟麗麗 王振宇 李婷婷 劉冉

摘要 前期研究發(fā)現，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有較好的生物活性，運用響應面法對黑木耳酸性多糖的最佳硫酸酯化工藝條件進行優(yōu)化研究。研究了氯磺酸與N，N-二甲基甲酰胺的體積比、酯化試劑的體積含量、反應溫度、反應時間、轉速5個因素對黑木耳多糖硫酸酯化取代度的影響。利用最陡爬坡試驗逼近因素的最大響應區(qū)域，采用Box-Behnken設計法對各因素的水平組合進行優(yōu)化，獲得黑木耳酸性多糖硫酸酯化優(yōu)化條件：氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺為1∶3.49、酯化試劑比例為33%、反應溫度50 ℃、反應時間112.84 min、轉速為200 r/min，在此優(yōu)化條件下硫酸酯化黑木耳酸性多糖的取代度可達0.490 5。

關鍵詞 黑木耳酸性多糖；硫酸酯化；響應面法；工藝條件優(yōu)化

中圖分類號 S646.6 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-09167-05

Study on the Optimization of Acid Auricularia Auricular Polysaccharides Sulfate Esterification Process by Response Surface Methodology

YIN Hong-li et al （Department of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract Previous studies have found that sulfate esterification Auricularia auricular acidic polysaccharides has good biological activity. Response surface methodology was adopted to optimize sulfuric acid esterification process conditions for Auricularia auricular polysaccharides. Effects of the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N- dimethyl formamide， the volume ratio of esterification reagent， the reaction temperature， the reaction time， rotational speed on degree of substitution of the ulfatex acid esterification for polysaccharide of Auricularia auricular were studied. The path of steepest ascent was used to define optimal response region for these three factors. Optimal level combinations of factors were obtained through Box-Behnken design. The optimal sulfuric acid esterification process conditions for polysaccharide of Auricularia auricular were as follows： the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N dimethyl formamide is 1∶3.49， the volume ratio of the esterification reagent is 33%， the reaction temperature is 50 ℃， the reaction time is 112.84 min， rotational speed is 200 r/min. Under optimal sulfuric acid esterification conditions， the DS of polysaccharide reached 0.490 5.

Key words Auricularia auricular acidic polysaccharides； Sulfuric acid esterification； Response surface methodology； Process conditions optimization

多糖（polysaccharide，簡稱PS）是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質，目前已有300多種多糖類化合物從天然產物中被分離^[1]。研究表明，黑木耳多糖具有許多重要的生理功能，如降血糖^[2-3]、降血脂^[4-5]、抗腫瘤^[6-7]、抗衰老^[8]、提高機體免疫等功能。硫酸酯化多糖 （Sulfated Polysacchides）除已證實具有抗凝血^[9]作用外，近年來不斷發(fā)現它有多種生物活性，如抗病毒的活性^[10]、提高多糖的免疫調節(jié)活性^[11-12]、抗氧化能力^[13]、抗腫瘤^[14]活性。目前研究了黑木耳多糖硫酸酯化在藥用價值、分離純化等方面的應用^[15]，而對黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制備工藝以及生理活性作用方面的研究還未見報道。前期研究發(fā)現，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有更好的生物活性，為了增強其功能性質，筆者對黑木耳酸性多糖硫酸酯化修飾進行了優(yōu)化試驗。

多糖硫酸酯的抗病毒活性、降血糖活性等與分子量、硫酸基取代度、糖苷鍵結構、給藥途徑等有關^[16]，其中取代度是主要的影響因素，因為硫酸基的引入可以改變多糖的立體構象，而構象的改變往往是生物活性變化的決定因素。因此，筆者以取代度為相關因素進行評估，通過該研究獲得高取代度的硫酸酯化黑木耳酸性多糖，從而為黑木耳資源的開發(fā)利用，以及開發(fā)新品種的保健因子、保健食品或藥品等應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 供試原料：黑木耳，黑龍江省海林市北味黑木耳。主要試劑：氯磺酸、N，N-二甲基甲酰胺、無水甲酰胺、乙醇、明膠（生化試劑），上?；瘜W試劑采購供應站；氯化鋇、濃鹽酸、無水硫酸鈉、三氯乙酸和氫氧化鈉均為分析純。

主要儀器：RE52-3旋轉蒸發(fā)儀、JB50-D型增力電動攪拌器、Spectru mlab53紫外可見分光光度計、EMS-8A加熱磁力攪拌器，天津歐諾儀器儀表有限公司；ALC-110.4電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDA-8002水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；756PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FD-18真空冷凍干燥機，上海田楓實業(yè)有限公司；BSZ-100自動部分收集器，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳酸性多糖的制備。

原料預處理→0.1 mol/L NaCl熱水浴浸提（料液比1∶50 g/ml、提取溫度為80 ℃、提取時間4 h）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液抽濾→用1 mol/L HCl調pH至7.0→濃縮→3%H₂O₂脫色→Sevage法除蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage試劑∶多糖溶液=1∶4）→醇沉24 h→離心→復溶→透析→凍干→多糖粗品。

多糖粗品過纖維素DEAE-52柱，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L NaCl洗脫，收集0.2 mol/L NaCl洗脫液，旋轉蒸發(fā)，透析，凍干后得到黑木耳酸性多糖。

1.2.2 磺酸化試劑制備。

準確量取一定體積N，N-二甲基甲酰胺置于附有冷凝裝置的三頸瓶中，然后將三頸瓶置于冰水浴中，并用鐵架臺固定，于磁力攪拌器上攪拌。用膠頭滴管以緩慢的速度將氯磺酸滴入N，N-二甲基甲酰胺中，制備得到氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺的磺酸化試劑，整個過程持續(xù)2～3 h。

1.2.3 黑木耳酸性多糖硫酸酯化的制備。

稱取一定真空冷凍干燥的黑木耳酸性多糖，溶于無水甲酰胺中，加入一定量的磺酸化試劑，在一定溫度及轉速條件下振蕩一段時間，反應結束后，迅速冷卻至室溫，加入3倍體積95%乙醇進行醇沉24 h。離心后取沉淀，用60%乙醇洗滌3次，將沉淀溶于50 ml蒸餾水中，攪拌后用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH至7.0，然后流水透析（3 500 Da）48 h，蒸餾水透析24 h。真空濃縮，醇沉，冷凍干燥得硫酸酯化黑木耳酸性多糖。得率計算公式如下：

1.2.4 取代度測定（DS）。

氯化鋇-明膠濁度法：取0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 ml硫酸鈉于具塞試管中，補加1 mol/L HCl至0.20 ml，分別加入3.8 ml 3%三氯乙酸（W/V）和1.0 ml氯化鋇-明膠混勻后靜置15 min。

以不含標液的0號管為空白，測360 nm吸光值，得硫含量與吸光度值之間的線性關系為：y=0.002 7x+0.005 2，其中相關系數R2=0.999 2符合要求。表明硫含量在設定的濃度范圍內與吸光值呈良好的線性關系，符合朗伯比爾定律。

稱取硫酸酯化衍生物4.5 mg于具塞試管中，加4.5 ml 1 mol/L HCl，100 ℃下水解2.5 h，冷卻至室溫后取0.2 ml進行測定，后續(xù)同標準曲線。

樣品取代度的計算：

DS=1.62×S%/（32-1.02×S%）

式中，DS 表示取代度；S%為樣品中硫的含量^[17]。

1.2.5 取代度的優(yōu)化試驗設計。

根據單因素試驗的結果，利用Plackett-Burman設計，以硫酸酯化多糖取代度作為考察指標，對相關因素進行評估，篩選出具有顯著效應的幾個因素。根據其試驗結果，在此基礎上，利用最陡爬坡試驗逼近以上3個因素的最大響應區(qū)域。采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選擇對多糖取代度影響大的幾個因素進行優(yōu)化試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素條件的確定

2.1.1 反應溫度對硫酸酯化黑木耳酸性多糖取代度的影響。

從圖1中可看出，黑木耳酸性多糖硫酸酯化中硫酸基取代度隨酯化溫度的升高呈先增大后減少的變化趨勢，當反應溫度升高超過50 ℃，DS開始下降，表明升高溫度有利于硫酸酯化反應的充分進行，但溫度升高超過一定程度后，在高溫環(huán)境下副反應占主導地位。由此得出，最佳反應溫度為50 ℃。

Plackeet-Burman主效應分析表中，Pr>|t|值表示其對應因素的顯著性，在95%的水平上，Pr>|t|值<0.05表示顯著。T檢驗值的大小顯示出因素對試驗結果影響的大小。通過Plackeet-Burman因素水平及主效應分析，選取影響顯著的3個因素作為最陡爬坡試驗的研究對象。

由表3可知，在試驗因素對硫酸酯化多糖取代度影響的試驗中， D對硫酸酯化多糖取代度產生正效應，A對硫酸酯化多糖取代度產生負效應。因素A、D的影響顯著，C次之，由于這幾個因素對取代度影響顯著，選擇其作為后續(xù)研究的因素。綜合以上分析，選取因素A、C、D作為最陡爬坡試驗的研究因素。

2.3 最陡爬坡試驗設計（Steepest ascent design）及結果

根據“2.2”的Plackett-Burman試驗分析的結果，綜合因素的正負效應確定其變化的方向，并縮小步長，進行最陡爬坡試驗，具體的試驗設計及結果見表4。

3 結論

該試驗優(yōu)化后確定的硫酸酯化黑木耳酸性多糖的最優(yōu)制備條件為： 反應溫度50 ℃、反應時間112.84 min、酯化試劑比例為33%、氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺為1∶3.49、轉速為200 r/min。在最優(yōu)工藝條件下進行驗證試驗，測得取代度為0.490 5，這與理論值誤差較小。所以，利用響應面法優(yōu)化得到硫酸酯化黑木耳酸性多糖的制備條件真實可靠，能夠為黑木耳酸性多糖硫酸酯化衍生物在保健因子、功能性食品或藥品領域中的應用提供理論依據，在實踐中具有指導意義。

目前研究了硫酸酯化黑木耳多糖在藥用價值、分離純化等方面的應用，而對黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制備工藝以及生理活性作用方面的研究還未見報道。該研究為黑木耳資源的開發(fā)利用，以及開發(fā)新品種的保健因子、保健食品或藥品等應用奠定了理論基礎。

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