靶向ELAM-1的磁共振分子探針的構(gòu)建與表征＊

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射科(廣西 南寧 530021)

劉樹(shù)英 古冬連 賴少侶 黃 秒 康 巍 金觀橋 蘇丹柯

靶向ELAM-1的磁共振分子探針的構(gòu)建與表征＊

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射科(廣西 南寧 530021)

劉樹(shù)英 古冬連 賴少侶 黃 秒 康 巍 金觀橋 蘇丹柯

目的探討用超順磁性氧化鐵(USPIO)螯合唾液酸化酶X(sLeX)形成靶向內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(ELAM-1)的特異性磁共振成像的分子探針的制備方法，并研究其物理化學(xué)特性。方法利用物理沉積方法合成USPIO納米顆粒，通過(guò)疏水作用，合成較好水溶性的PEG-USPIO，其表面?COOH充分活化，常溫下與sLeX充分孵育，超濾離心和去離子水洗滌，形成磁共振分子探針USPIO-PEG-sLeX，測(cè)定其表征。結(jié)果透射電鏡測(cè)定PEG-SPIO平均粒徑為(10±2.6)nm，分散性較好，大小適宜；動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定偶聯(lián)前后其平均水動(dòng)力尺寸分別為(34.06±9.95) nm，(53.35±16.99)nm；偶聯(lián)前后的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96)mV，(-12.6±5.33)mV。結(jié)論化學(xué)交聯(lián)法可成功制備磁共振分子探針USPIO-PEG-sLeX，該分子探針具有良好表征，有望滿足體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)特異性結(jié)合ELAM-1的要求。

磁共振分子成像；超順磁性氧化鐵；內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1

近年來(lái)，隨著納米顆粒制備技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是新一代超順磁性氧化鐵納米顆粒和超小型的氧化鐵顆粒(USPIO)出現(xiàn)，大大地促進(jìn)磁共振分子影像學(xué)的發(fā)展[1-2]。然而，單一的USPIO缺乏靶向性，其成像技術(shù)并不能夠?yàn)橐恍?fù)雜的病情作出明確的診斷，這使得制備出靶向造影劑成為必要[3-4]。內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(ELAM-1)，也稱E選擇素(E-selectin)，是選擇素家族中的一員[5-6]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到IL-1，TNF-α,LPS等刺激活化后即在細(xì)胞表面表達(dá)ELAM-1。ELAM-1的配體為細(xì)胞膜上的糖蛋白或糖脂，含有唾液酸化酶X(sLeX)。ELAM-1和其配體sLeX在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用，其異常表達(dá)對(duì)判斷腫瘤預(yù)后以及個(gè)體化綜合治療方案的制定具有重要參考價(jià)值，可見(jiàn)特異性結(jié)合ELAM-1的靶向磁共振造影劑具有良好的臨床應(yīng)用前景。本文將油酸包裹的PEG-USPIO納米顆粒偶聯(lián)sLeX合成分子探針USPIO-PEG-sLeX，旨在制備出能夠在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中能夠與ELAM-1特異性地結(jié)合，并檢測(cè)其表達(dá)部位及數(shù)量的磁共振分子探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器乙酰丙酮鐵、油酸、油胺、EDC固體粉末、NHS固體粉末、二芐基醚、MES粉末、硼砂溶液和硼酸溶液購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司，乙醇、正己烷和氯仿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DSPE-PEG2000固體粉末上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，sLeX購(gòu)自英國(guó)Carbosynth公司。超聲儀(VCX750)，離心機(jī)(Centrifuge5430R)，透射電子顯微鏡(日本JEM-200CX)，粒徑分析儀(美國(guó)Brookhaven-Zetaplus)。

1.2 USPIO-PEG-sLeX的制備

1.2.1 油酸包裹的PEG-USPIO納米顆粒的制備：先取2mmol乙酰丙酮鐵、10mmol 1,2-十六醇、20ml二芐基醚、6mmol油酸和6mmol油胺進(jìn)行加熱反應(yīng)，停止加熱并冷卻到室溫后，向反應(yīng)液中加入40ml乙醇，將混合物離心處理(6000r/min)，得到黑色的沉淀物。重復(fù)乙醇沉淀/非極性溶劑分散的過(guò)程2～3次，得到平均尺寸為6nm四氧化三鐵納米顆粒。將上述方法合成的84mg四氧化三鐵納米晶體分散在 4ml正己烷溶液中，再加入2mmol乙酰丙酮鐵、10mmol 1,2-十六醇、20ml二芐基醚、6mmol油酸和6mmol油胺重復(fù)進(jìn)行如上反應(yīng)，最終得到平均粒徑為10nm的四氧化三鐵納米顆粒。稱取50mg DSPE-PEG2000固體粉末溶解于5ml三氯甲烷中，移取5ml的上述油酸包覆的四氧化三鐵納米晶體(濃度為1mg Fe/ml，分散在氯仿中)，將兩者混合裝于50ml的圓底燒瓶，在70℃(與脂質(zhì)體的相變溫度相當(dāng))下用超聲儀充分超聲10分鐘后加入5ml去離子水。兩者混合后將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，水浴70℃，抽至真空后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。通過(guò)疏水作用，在顆粒表面修飾的油酸烷基鏈上包覆了單層具有較好水溶性的DSPE-PEG2000磷脂分子。樣品經(jīng)220nm濾膜過(guò)濾后再超濾離心，去除底部沉淀物，取上層黑色透明的水相納米結(jié)構(gòu)的溶液。

1.2.2 PEG-USPIO偶聯(lián)sLeX分子的制備：首先，需配制反應(yīng)體系中需要的緩沖溶液。稱取213mg的MES粉末，溶解后用去離子水定容到50mL容量瓶中，調(diào)pH 至5.5，備用。分別移取3ml硼砂溶液(0.05mol/L)和7ml硼酸溶液(0.2mol/L)，兩者混合后用去離子水定容到100ml，調(diào)pH 至8.3，備用。接著，移取5ml已制備的Fe3O4-PEG樣品(其中DSPE-PEG2000-COOH的原始投料量約為50mg)分散于20ml濃度為0.02mol/L的MES緩沖溶液中，依次向其中加入180mg EDC固體粉末和200mgNHS固體粉末，充分溶解后于搖床上振蕩25分鐘(150r/ min)，以確保磁性納米晶表面的-COOH充分活化。活化結(jié)束后，超濾離心，用去離子水洗滌3次，以去除多余的EDC和NHS。將上述樣品分散于20ml 0.02mol/L 的BB緩沖溶液中，加入2mg sLeX分子(先分散于0.02mol/L的BB緩沖液中)，于搖床上常溫孵育2小時(shí)(150r/min)。最后超濾離心，用去離子水洗滌3次，得到黑色透明狀的sLeX偶聯(lián)的磁性納米晶(UPSIO-PEG-sLeX)的溶液，經(jīng)220nm濾膜過(guò)濾后保存于4℃冰箱。

1.3 USPIO-PEG-sLeX表征的測(cè)定

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)：分析USPIO-PEG-sLeX的形態(tài)和粒徑：再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的處理后將用超純水(PH6.0)稀釋為1mg/ ml 的USPIO-PEG-sLeX溶液，用一次性吸液管分別取一小滴于的蠟板中，先用2%磷鎢酸(PTA)對(duì)乳酸作負(fù)染處理，用移液槍吸取樣品滴在銅網(wǎng)上，蓋好培養(yǎng)皿，待銅網(wǎng)自然干燥后，用放入80kv透射電子顯微鏡下，觀察USPIO-PEG-sLeX微粒的形態(tài)和粒徑，隨機(jī)選取50個(gè)納米微粒，測(cè)量其平均粒徑，重復(fù)三次，取其平均值。

1.3.2 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的平均水動(dòng)力尺寸：在室溫下，偶聯(lián)前后的USPIO-PEG-sLeX乳液用超純水稀釋后放入2ml Eppendorf管中，放置于超聲波清洗器中，均勻振蕩反應(yīng)5min；開(kāi)啟粒徑分析儀，待機(jī)器預(yù)熱30min后，用移液槍吸取1.5ml的偶聯(lián)前后的USPIO-PEG-sLeX溶液于透明的塑料杯中，放入Zeta粒徑分析儀，采用動(dòng)態(tài)光散射分別測(cè)量偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒及偶聯(lián)后的sLeX偶聯(lián)磁性納米顆粒復(fù)合物的水動(dòng)力尺寸，重復(fù)三次，取其平均值。

1.3.3 粒徑分析儀檢測(cè)偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的Zeta電位：在室溫下，將USPIO-PEG-sLeX乳液用超純水(PH6.0)稀釋后，裝于1.5ml的Eppendorf管中，開(kāi)啟Zeta粒徑分析儀，待機(jī)器預(yù)熱30min后進(jìn)行測(cè)量,用移液槍吸取1ml的納米微粒溶液于透明的塑料杯中，放入Zeta粒徑分析儀測(cè)定偶聯(lián)前、后納米顆粒的Zeta電位，重復(fù)三次，取其平均值。

2 結(jié) 果

USPIO-PEG-sLeX溶液顏色呈淡黃色，澄清，沒(méi)有明顯的沉淀，分散性較好。TEM顯示USPIOPEG-sLeX靶向磁性納米顆粒呈細(xì)顆粒狀外觀，大小均勻，散在分布，磷鎢酸染色后的PEG化磁性納米顆粒的磁核尺寸約為(10±2.6) nm(圖1)。

DLS測(cè)得偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒其平均水動(dòng)力尺寸為(34.06±9.95)nm(圖2)，偶聯(lián)后的sLeX偶聯(lián)磁性納米顆粒復(fù)合物的平均水動(dòng)力尺寸為(53.35±16.99)nm（圖3）。從圖中可看出納米顆粒及復(fù)合物的尺寸分布范圍較窄，粒徑分布較均一。

偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒的氨基末端顯正電，Zeta激光粒度儀測(cè)得偶聯(lián)前的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96)mV(圖4)。偶聯(lián)后的PEG化磁性納米顆粒的sLeX通過(guò)羧基與納米顆粒表面氨基結(jié)合，磷脂PEG的磷酸根基團(tuán)顯負(fù)電，測(cè)得Zeta電位(-12.6±5.33)mV(圖5)。

圖1 USPIO-PEG-sLeXTEM電鏡圖（2%的磷鎢酸負(fù)染）。圖2-3 DLS測(cè)得偶聯(lián)前（圖2）后(圖3)PEG化磁性納米顆粒其平均水動(dòng)力尺寸。圖4-5 Zeta 電位測(cè)得偶聯(lián)前（圖4）后(圖5)PEG化磁性納米顆粒其電位。

3 討 論

ELAM-1分子量為115ku，由589個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，也主要集中于毛細(xì)血管后微靜脈，內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后，可維持24h然后從胞膜上脫落進(jìn)入血液，成為可溶性ELAM-1[7]。ELAM-1在正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ELAM-1僅在甲狀腺、淋巴結(jié)、扁桃體血管中表達(dá),大多數(shù)人體組織未見(jiàn)表達(dá)。ELAM-1的配體為細(xì)胞膜上的糖蛋白或糖脂，含有sialyl-Lewisx及其同分異構(gòu)體sialyl-Lewisa。ELAM-1及其配體參與了腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，應(yīng)用生物治療方法有選擇性地阻斷ELAM-1等粘附分子與腫瘤細(xì)胞之間相互作用，達(dá)到阻止或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移[8-9]。本文合成分子探針USPIO-PEG-sLeX，將可能成功地用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向治療的可能。

本實(shí)驗(yàn)采用PEG表面修飾的Fe3O4作為磁共振造影劑，并利用其表面羧基與具有靶向識(shí)別腫瘤表面分子表達(dá)的sLeX進(jìn)行耦聯(lián)，制備出具有腫瘤靶向性的磁共振分子探針。USPIO-PEG-sLeX納米顆粒的表征結(jié)果表明，經(jīng)PEG修飾的Fe3O4粒子呈球形，大小均勻，分散性較好，平均粒徑10nm左右。相比于配體交換的表面修飾方法對(duì)于顆粒形貌及性質(zhì)具有破壞和削弱作用[10]，本文通過(guò)疏水相互作用在油相納米顆粒表面進(jìn)行PEG化修飾的方法更具優(yōu)勢(shì)。以兩親性DSPE-PEG2000為表面活性劑，制備得到Fe3O4-PEG納米顆粒，透射電鏡表征結(jié)果顯示PEG化修飾后的納米顆粒保持了原有的形貌和尺寸,而且PEG化后的氧化鐵納米顆粒具有較低的類酶活性，能夠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)有效躲避小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬。同時(shí)，PEG包裹在Fe3O4的表面產(chǎn)生配位作用，它可降低磁性納米粒子的表面自由能和疏水作用力，且形成一定的空間位阻，從而減少了Fe3O4納米粒子的團(tuán)聚，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)的優(yōu)勢(shì)。

聚合物的水動(dòng)力學(xué)尺寸指的是聚合物水溶液中包裹著聚合物分子的水化分子層的尺寸，聚合物濃度增加到一定程度，聚合物鏈將發(fā)生明顯的纏結(jié)作用，導(dǎo)致聚合物的分子尺寸會(huì)增大[11-12]。本文結(jié)果顯示，DLS測(cè)得偶聯(lián)前后PEG化磁性納米顆粒其平均水動(dòng)力尺寸為(34.06±9.95) nm和(53.35±16.99)nm，而且納米顆粒及復(fù)合物的尺寸分布范圍較窄，粒徑分布較均一。USPIOPEG-sLeX乳液中納米粒子以一定尺寸分布的聚集體的形式存在其中，磁性納米粒子的聚集和表面生物分子吸附主要通過(guò)對(duì)水動(dòng)力尺寸的改變來(lái)影響其特征頻率，磁偶極相互作用和范德瓦爾茲力導(dǎo)致USPIO-PEG-sLeX聚集的原因。本文通過(guò)PEG表面修飾，在表面引入更多的電荷和有機(jī)分子阻擋層可以改善這種聚集。同時(shí)，USPIO-PEG-sLeX窄的粒子尺寸分布能夠降低磁化率譜的寬度，從而可進(jìn)一步增加磁共振分子成像檢測(cè)其靈敏度，因此，USPIO-PEG-sLeX屬于磁敏感探針。

Zeta電位的重要意義反映了偶聯(lián)前后USPIO-PEG-sLeX的穩(wěn)定性。Zeta電位是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力的強(qiáng)度的度量,分子或分散粒子越小，Zeta電位(正或負(fù))越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta電位(正或負(fù))越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚，即吸引力超過(guò)了排斥力，分散被破壞而發(fā)生凝結(jié)或凝聚[13-14]。本文結(jié)果顯示，電位偶聯(lián)前后的PEG化磁性納米顆粒的Zeta電位分別為(11.6±3.96) mV，(-12.6±5.33)mV，提示了USPIO-PEG-sLeX的穩(wěn)定性一般。

總之，油酸包裹的PEG-Fe3O4納米顆粒與ELAM-1的特異性配體sLeX偶聯(lián)形成復(fù)合物(USPIO-PEG-sLeX)，該分子探針具有良好表征，有望滿足體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)特異性結(jié)合ELAM-1的要求，對(duì)監(jiān)測(cè)ELAM-1在腫瘤的表達(dá)以及預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)等方面應(yīng)用具有廣闊應(yīng)用前景。

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(本文編輯: 張嘉瑜)

Construction and Characterization of MR Molecular Probe Targeted Endothelial Cell Adhesion Molecule-1*

LIU Shu-ying, GU Dong-lian, LAI Shao-lv,et al., Department of Radiology,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi Province,China

ObjectiveTo investigate the methods of preparing a specific molecular probe for magnetic resonance imaging targeting endothelial cell adhesion molecule-1 (ELAM-1) with ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide(USPIO) chelating sialyl-Lewis X (sLeX), and research its physicochemical properties.MethodsUsing physical deposition method to synthesis USPIO nanoparticles. By hydrophobic interactions, preferable water-soluble PEG-SPIO was synthesized and the surface -COOH was sufficiently activated,then incubated with sufficient sLeXat room temperature, purified by centrifugal ultrafiltration and washed with deionized water. The magnetic resonance molecular probe USPIO-PEG-sLeXwas prepared and characterize it.ResultsTEM results revealed that the PEG-SPIO had a size of (10±2.6)nm with good dispersibility and suitable size. DLS study showed that before and after coupling,the hydrodynamic mean diameter were (34.06±9.95)nm and (53.35±16.99) nm, respectively. Zeta potential study showed that before and after coupling the potential of PEG conjugated magnetic nanoparticles potential were (11.6±3.96) mV and (-12.6±5.33) mV,respectively.ConclusionThe method of chemical conjugation can be successfully prepared MRI molecular probe USPIO-PEG-sLeX, which has a well-characterized molecular probe, and it is expected to meet vivo experiments specifically binds to ELAM-1 requirements.

Magnetic Resonance Molecular Imaging; Ultrasmall Superparamagnetic Particles of Iron Oxide; Endothelial Cell Adhesion Molecule-1

R445.2

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO.81260334和81460452)

10.3969/j.issn.1672-5131.2016.08.043

蘇丹柯

2016-06-28