產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌ZF—03的分離鑒定與酶學性質(zhì)研究

趙喜云　張杰　熊文　王嬌　張映

摘要[目的] 研究鹽堿地產(chǎn)脂肪酶的中度嗜鹽菌菌株的形態(tài)和生理生化特點及其所產(chǎn)胞外脂肪酶的性質(zhì)。 [方法]利用平板篩選法分離得到一株產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌，對其進行形態(tài)、生理生化和分子水平的鑒定，并對其產(chǎn)生的脂肪酶的部分酶學性質(zhì)進行研究。[結果]產(chǎn)脂肪酶的菌株命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。對脂肪酶粗酶液酶學性質(zhì)的研究結果顯示該脂肪酶的最適反應溫度在46～50 ℃之間，溫度小于70 ℃時的穩(wěn)定性較好；最適pH為8.5，在pH 7.5～9.5范圍內(nèi)，相對酶活性較高，酶具有良好的穩(wěn)定性；反應的最適NaCl濃度為0～3%，在0～5% NaCl濃度下有很好的穩(wěn)定性。[結論]分離得到了一株產(chǎn)脂肪酶活性較高的中度嗜鹽菌。

關鍵詞中度嗜鹽菌；脂肪酶；鑒定；酶學性質(zhì)

中圖分類號S181.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01138-03

基金項目2013年度大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201310225116）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助（DL11CA01）；東北林業(yè)大學國家基礎科學人才培養(yǎng)基金——科研訓練及科研能力提高項目（201218A3）；哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才基金資助項目（RC2009QN015018）；黑龍江省自然科學基金面上資助項目（E201148）。

作者簡介趙喜云（1989- ），女，山東聊城人，本科生，專業(yè)：環(huán)境微生物。*通訊作者，副教授，博士，從事環(huán)境微生物研究。

中度嗜鹽菌是一群能在含有0～32%NaCl的環(huán)境中生長的極端環(huán)境微生物。在所有嗜鹽微生物中，中度嗜鹽菌在自然界中廣泛分布可生長的鹽度范圍最廣，由于中度嗜鹽菌獨特的生理性質(zhì)，其功能酶具有較大范圍的鹽耐受性、熱耐受性和對有機溶劑的抗性，在酶工業(yè)中，其所生產(chǎn)的酶制劑在特殊條件的生產(chǎn)和研究中可以保持較好的活性，因此，中度嗜鹽菌在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的研究價值和廣闊的應用前景[1-2]。

由于工業(yè)生產(chǎn)中某些生產(chǎn)條件的限制，已有的水解酶往往達不到最大活性，因此尋找能夠適應不同溫度、酸堿度以及鹽水活度的極端水解酶就成為一類重要的課題[3-5]。該研究分離得到了一株產(chǎn)脂肪酶活性較高的中度嗜鹽菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化及16S rDNA序列分析鑒定，初步命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03，并對其不同溫度、pH、鹽度條件下的酶學性質(zhì)進行了研究，為進一步提高酶活性并進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣。試驗土樣為大慶采油四廠附近的鹽堿土。

1.1.2培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L，NaCl 30～120 g/L（不同鹽度梯度），蒸餾水至1 000 ml，pH為7.5～8.0。

脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白5 g/L，酵母粉6 g/L，蛋白胨6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L，NaCl（視需要量），20 ml橄欖油乳化液，蒸餾水至1 000 ml。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基或種子培養(yǎng)基：同富集篩選培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基固體平板均加入18～20 g/L瓊脂。

1.1.3主要試劑。Taq酶、dNTP、Taq酶buffer、16S rDNA通用引物購自大連TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1菌種的篩選。參考文獻[6]進行產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選。

1.2.2菌種鑒定。

1.2.2.1形態(tài)學鑒定。將分離得到的純菌點種于固體種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，記錄單菌落的顏色，包括正反面、邊緣、中央部分顏色，記錄單菌落的形狀，包括菌落及邊緣的形狀，記錄菌落透明度、大小、表面隆起及菌落培養(yǎng)基的顏色等。在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)大小。并做革蘭氏染色、芽孢染色及細胞運動性試驗。

1.2.2.2生理生化鑒定。參照文獻[7]進行氧化酶、過氧化氫酶、酯酶、脂肪酶、淀粉酶、酪素降解、明膠水解等生理生化鑒定。

1.2.2.316S rDNA分子鑒定。參考文獻[8-9]進行16S rDNA分子鑒定，利用ClustalX 1.83軟件進行同源性分析，再用MEGA 4.0軟件中N-J法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3酯酶活力測定。參照文獻[9]方法制備粗酶液，測定脂肪酶活力。

2結果與分析

2.1菌株的篩選獲得了幾株產(chǎn)脂肪酶菌株，其中一株水解圈直徑17.33 mm，菌落直徑4.33 mm，酶活力較高，為7.18 U/ml，命名為ZF03。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)及生理生化特征。將ZF03菌株于37 ℃條件下倒置培養(yǎng)3 d 后，觀察到的菌落形態(tài)為圓形，表面光滑，不透明，邊緣整齊，菌落白色，中間稍凸起，不粘稠，光滑無皺紋。菌體染色后，在光學顯微鏡下觀察菌體，細胞呈球狀、多聯(lián)球或成團，革蘭氏染色呈陽性，無芽孢、穿刺培養(yǎng)無擴散現(xiàn)象。生理生化特性試驗結果中酯酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、脂肪酶、蔗糖反應為陽性結果；氧化酶、過氧化氫酶、淀粉酶、酪素降解、明膠水解、吲哚反應、H2S產(chǎn)生、乳糖、果糖反應為陰性結果。

2.2.216S rDNA分子鑒定。將ZF03菌株的16S rDNA 序列進行PCR、電泳回收純化后直接進行測序分析，最終確定所得序列長度為1 416 bp。

在NCBI中，將所得序列結果進行Blast同源性查找比對，并用MEGA 4.0軟件中NJ法構建ZF03菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖1所示。圖2表明與ZF03菌株的序列同源性達到97%以上的都是Nesterenkonia屬的菌種，ZF03與Nesterenkonia halobia strain DSM 20541和Nesterenkonia halophila strain YIM 70179的親緣關系最近，而ZF03與YIM 70179的形態(tài)學特征理化性質(zhì)基本一致，因此，菌種ZF03可能就是YIM 70179或者是同一祖先進化的產(chǎn)物?？梢源_定的是ZF03為耐鹽的涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia halobia）[9-10]，所以暫且命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。

2.3.1溫度對ZF03脂肪酶活性的影響。

2.3.1.1ZF-03脂肪酶最適反應溫度。在不同溫度條件下保溫15 min利用對硝基苯酚棕櫚酸酯為反應底物，加入粗酶液1 ml，反應10 min在410 nm波長下測定脂肪酶活性。以相對酶活性為縱坐標來表示測定結果（即活性最高的為100%），以下測定同此。由圖2可見，在45～55 ℃條件下脂肪酶活性比較高，最適反應溫度在46～50 ℃之間，當反應溫度超過55 ℃后，隨著溫度的升高，脂肪酶活性在下降。

2.3.2.1ZF03脂肪酶最適反應pH。將酶分別加入不同pH的反應液中，最適宜反應溫度下測定酶活力，結果見圖4。由圖4可見，脂肪酶與底物作用的最適pH為8.5，此時酶活力最大，在pH為7.5～9.5范圍內(nèi)，酶反應的活力較高，小于7.5或者大于9.5時，該酶活性呈明顯降低的趨勢。

2.3.3.1ZF03脂肪酶最適反應NaCl濃度。配制不同鹽度0、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（W/V）的反應液，在最適pH和最適溫度下，加入底物反應10 min，然后測定酶活力。由圖6可見，反應的最適NaCl濃度為0～3%，但在0～10%濃度下相對酶活性也可以達到80%以上，當鹽濃度大約15%時，酶活力快速減弱，可能高鹽環(huán)境抑制了酶的活性。

3結論

（1）從大慶采油廠附近鹽堿土中分離篩選出一株高產(chǎn)脂肪酶的中度嗜鹽菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化及16S rDNA序列分圖7NaCl濃度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響析把其命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。

（2）對脂肪酶粗酶液酶學性質(zhì)的研究結果顯示該脂肪酶的最適反應溫度在46～50 ℃之間，溫度小于70 ℃時的穩(wěn)定性較好；最適pH為9.0，在pH 7.0～9.5范圍內(nèi)，相對酶活性較高，酶具有良好穩(wěn)定性；反應的最適NaCl濃度為0～3%，在0～5% NaCl濃度下有很好的穩(wěn)定性。

（3）該研究摸索出了一種篩選鹽堿土中產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌的方法，分離鑒定出了產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌的新菌株，并對其不同溫度、pH、鹽度條件下的酶學性質(zhì)進行了研究，為進一步提高酶活性并進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路。

參考文獻

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[5] OREB A.Molecular ecology of extremely halophilic archaea and bacterial[J].FEMS Microbiology Ecology，2002，39：1-7.

[6] 張曉梅，竇文芳，許泓瑜，等.一株產(chǎn)脂肪酶嗜鹽菌的鑒定及耐鹽機理[J].應用與環(huán)境生物學報，2010，16（1）：100-103.