秋水仙堿誘導(dǎo)山楊異源多倍體

李靜　李春明　卓泳杉　楊玉煥

摘要[目的]利用綜合倍性育種和雜交優(yōu)勢的多倍體育種培育山楊優(yōu)良新品種。[方法]以中國山楊及其雜交品種中美山楊為母本，山楊和新疆楊為父本，進(jìn)行樹上雜交與切枝水培雜交，對授粉后的雌花序施加秋水仙堿進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測植株倍性。[結(jié)果]切枝水培雜交，授粉48 h后，以濃度0.3%秋水仙堿持續(xù)處理24 h，誘導(dǎo)三倍體效果最佳；授粉96 h后，以濃度0.3%秋水仙堿持續(xù)處理24 h，誘導(dǎo)四倍體效果最佳。另外樹上雜交，授粉96 h后，以濃度0.1%秋水仙堿持續(xù)處理48 h，誘導(dǎo)三倍體效果最佳；授粉120 h后，以濃度0.1%秋水仙堿持續(xù)處理48 h，誘導(dǎo)四倍體效果最佳。[結(jié)論]對山楊、中美山楊授粉后施加秋水仙堿處理，成功獲得了三倍體與四倍體，結(jié)果表明利用秋水仙堿溶液誘導(dǎo)山楊多倍體行之有效。

關(guān)鍵詞山楊；多倍體；秋水仙堿

中圖分類號S792.11文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01098-03

基金項目黑龍江省森工總局基礎(chǔ)研究項目（sgzjY2013003、sgzjY2010012）；黑龍江省財政廳自擬項目（201204，201303）。

作者簡介李靜（1986-），女，山東臨邑人，碩士研究生，研究方向：楊樹倍性育種。*通訊作者，副教授，從事細(xì)胞活性物質(zhì)利用研究。

山楊（Populus davidiana Dode.）屬白楊派，又稱中國山楊，在我國廣泛分布，抗寒、耐旱，是撂荒地、采伐跡地和火燒跡地森林更新的先鋒樹種。山楊木材結(jié)構(gòu)均勻、質(zhì)輕而軟、顏色淡白，纖維長、寬、長寬比和纖維素含量等均高于大青楊、香楊和小黑楊等，不用填充其他原料即可用于造紙[1]。山楊這些特性在短周期紙漿材等森林工業(yè)用材生產(chǎn)中具有明顯優(yōu)勢[2-4]。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國對紙張的需求驟增，同時對紙張品質(zhì)的要求也在不斷提高。山楊作為優(yōu)質(zhì)紙漿原材，其可利用的天然林日漸減少，此時就需要營造大量人工林來填補天然林供應(yīng)不足的空缺。

國內(nèi)外有關(guān)倍性育種的實踐證明，多倍體育種由于染色體倍數(shù)性增加，常常帶來一些形態(tài)和生理上的變化，其在提高種子生長速度、增進(jìn)遺傳品質(zhì)以及提高目的代謝物含量等方面具有優(yōu)勢，可以通過一輪次育種過程實現(xiàn)多目標(biāo)性狀遺傳改良。楊樹多倍體在材積生長量、木材品質(zhì)以及抗性方面具有很大優(yōu)勢[5-8]。目前關(guān)于山楊的遺傳改良主要集中于選優(yōu)、雜交育種等方面，迄今未見有關(guān)山楊多倍體誘導(dǎo)成功的研究報道。該研究主要以山楊及其雜種為材料，對授粉后施加秋水仙堿溶液誘導(dǎo)山楊多倍體的技術(shù)條件進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料以山楊以及雜交品種中美山楊為母本，山楊和新疆楊為父本。其中山楊取自黑龍江省林口縣青山林場山楊基因保存林，新疆楊取自阿克蘇地區(qū)，中美山楊取自黑龍江省林業(yè)科學(xué)院院內(nèi)保存林，是引進(jìn)生長優(yōu)異的美洲山楊花粉與優(yōu)良種源的中國山楊進(jìn)行地理遠(yuǎn)源雜交選育出的優(yōu)良品種。

于2月上旬，收集楊樹枝條，選擇直徑為1～2 cm，無病蟲害、帶有花芽的、健壯的枝條，將雌花枝剪成1.5～2.0 m長，雄花枝剪成1.0 m左右，用塑料薄膜將上述花枝包裹后帶回哈爾濱，低溫保存?zhèn)溆肹9]。

1.2研究方法

1.2.1 雜交育種。雜交育種分為樹上雜交與切枝水培雜交。樹上雜交利用的是位于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院院內(nèi)的中美山楊保存林。切枝水培雜交以山楊為母本。首先將選擇好的雄花枝進(jìn)行室內(nèi)切枝水培，收集花粉，干燥，貯藏于4 ℃冰箱備用。觀察雌花發(fā)育情況，到可授期時分別用上述花粉授粉[10-12]。

1.2.2 利用秋水仙堿誘導(dǎo)加倍。授粉后施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)加倍，自授粉48 h后，對雌花序進(jìn)行秋水仙堿誘導(dǎo)處理，處理方式為瓶浸法，秋水仙堿溶液濃度為0.1%、0.3%、0.5%，切枝雜交為處理持續(xù)時間24、36、48 h，樹上雜交為處理持續(xù)時間24、48、72 h。繼續(xù)培養(yǎng)至蒴果開裂、吐絮時，套袋、收取種子，點播于經(jīng)高溫滅菌的土中，適時移入營養(yǎng)缽，待其繼續(xù)長至25 cm高時移栽大田。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測子代倍性。利用流式細(xì)胞儀檢測山楊雜種子代倍性，具體方法如下，取約2 cm×2 cm生長正常的展開葉片置于培養(yǎng)皿里，加入2 ml 4 ℃預(yù)處理的提取緩沖液[1 000 ml為例，10 mmol/L MgSO4·7H2O 2.46 g，50 mmol/L KCl 3.727 5 g，5 mmol/L HEPES 1.191 5 g，1%（W/V） PVP-40 10 g，0.25%（V/V） Triton X-100 2.5 ml，pH=8.0]，用鋒利的刀片快速將其切碎；葉片組織搗碎液用30 μm濾網(wǎng)過濾至上樣管中，收集的濾液中加入1 ml Staining solution（Partec）染液，充分混勻后染色5 min；采用Partec CyFlow-PA型流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行染色體倍性檢測。

2 結(jié)果與分析

以山楊、中美山楊為母本，山楊、新疆楊為父本進(jìn)行雜交，切枝水培雜交與樹上雜交授粉后施加秋水仙堿處理，都獲得了三倍體與四倍體。

2.1授粉后施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)多倍體

2.1.1 切枝水培雜交。以優(yōu)良種源山楊為母本，新疆楊為父本，授粉后，利用不同濃度秋水仙堿浸泡山楊雌花序，誘導(dǎo)山楊雜種三倍體或四倍體。倍性檢測結(jié)果表明，有2個處理組合獲得三倍體，共4株，有1個處理組合獲得四倍體2株。其中，授粉48 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續(xù)24 h，保留2年生雜種子代苗6株，其中三倍體2株，誘導(dǎo)比例達(dá)33.3%（表1），另外，授粉72 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續(xù)24 h，保留2年生雜種子代苗42株，其中三倍體1株，誘導(dǎo)比例為2.3%。授粉96 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續(xù)24 h，保留2年生雜種子代苗11株，其中四倍體2株，誘導(dǎo)比例為18.2%。因此，授粉48 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續(xù)24 h，誘導(dǎo)山楊產(chǎn)生3倍體效果最好，授粉96 h后，以0.3%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續(xù)24 h，誘導(dǎo)山楊產(chǎn)生四倍體效果最好。

2.1.2 樹上雜交。以中美山楊為母本，優(yōu)良種源山楊為父本，授粉后，利用不同濃度秋水仙堿浸泡山楊雌花序，誘導(dǎo)山楊雜種三倍體或四倍體。倍性檢測結(jié)果表明，有1個處理組合獲得三倍體2株，有1個處理組合獲得四倍體1株。授粉96 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續(xù)48 h，保留2年生雜種子代苗75株，其中三倍體2株，誘導(dǎo)比例達(dá)2.7%（表2），另外，授粉120 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，處理持續(xù)48 h，保留2年生雜種子代苗16株，其中四倍體1株，誘導(dǎo)比例為6.3%。因此，授粉96 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續(xù)48 h，誘導(dǎo)山楊產(chǎn)生三倍體效果最好，授粉120 h后，以0.1%濃度的秋水仙堿浸泡山楊雌花序，持續(xù)48 h，誘導(dǎo)山楊產(chǎn)生四倍體效果最好。

2.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定植株倍性采用Partec CyFlow-PA型流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行染色體倍性檢測。測試樣品細(xì)胞核DNA的含量是以對照為標(biāo)準(zhǔn)的相對值（圖1）。

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