三丁基氯化錫對(duì)僧帽牡蠣抗氧化酶活性的影響

陳細(xì)香　吳文杰　陳小青　柯江波

摘要[目的] 探討三丁基氯化錫（TBTCl）對(duì)僧帽牡蠣抗氧化酶系統(tǒng)毒性的影響程度及致毒機(jī)制。[方法] 在實(shí)驗(yàn)室條件下，研究不同濃度（1、2、5、10和100 ng/L）的三丁基氯化錫（TBTCl）在不同暴露時(shí)間（24、72、96 h）對(duì)僧帽牡蠣消化腺和鰓的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和硒依賴谷胱甘肽過氧化酶（SeGPx）活性的影響。[結(jié)果] 當(dāng)TBTCl濃度為1和2 ng/L時(shí)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間TBTCl對(duì)消化腺和鰓內(nèi)SOD和SeGPx活性無(wú)顯著影響（P>0.05），而對(duì)消化腺CAT活性有顯著誘導(dǎo)作用（P<0.05）。當(dāng)TBTCl濃度為5 ～100 ng/L時(shí)，SOD、CAT和SeGPx的活性都呈現(xiàn)不同程度的時(shí)間劑量依賴關(guān)系。[結(jié)論] 該研究可為餐桌食品污染的防患、無(wú)公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)和環(huán)境檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞三丁基氯化錫；僧帽牡蠣；消化腺；鰓；SOD；CAT；Se–GPx

中圖分類號(hào)S985.3+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-01075-04

基金項(xiàng)目福建省科技廳青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目（2008F3095）；福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目（A102）；碩士學(xué)位授予單位立項(xiàng)建設(shè)學(xué)科（生物學(xué)）。

作者簡(jiǎn)介陳細(xì)香（1972- ），女，福建莆田人，副教授，博士，從事環(huán)境生態(tài)學(xué)研究。

有機(jī)錫化合物對(duì)海洋生物的影響越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注[1-2] 。生物體內(nèi)積累有機(jī)錫，以毒性最強(qiáng)的三丁基氯化錫（Tributyltin chloride，TBTCl）濃度最高。由于有機(jī)錫在海洋環(huán)境中的長(zhǎng)期殘留，即使在停止使用相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后，海水和底泥中仍會(huì)存在三丁基氯化錫（TBTCl）[3] 。我國(guó)污染海域中有機(jī)錫質(zhì)量濃度從幾ng/L 到幾百ng/L不等[4]。江桂斌等[5]通過對(duì)我國(guó)沿海和內(nèi)陸水域地區(qū)的采樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有采樣點(diǎn)都存在有機(jī)錫的污染情況。Zhou 等[6]對(duì)我國(guó)7個(gè)城市采集的海產(chǎn)品進(jìn)行了測(cè)定，均發(fā)現(xiàn)了TBTCl的存在，即使經(jīng)蒸煮烹調(diào)后TBTCl仍然存在。

三丁基氯化錫（TBTCl）的重要用途之一就是用于船體涂層添加物以防止粘附生物的增長(zhǎng)，但同時(shí)也對(duì)牡蠣等非目標(biāo)生物構(gòu)成威脅[7-9] 。筆者研究三丁基氯化錫（TBTCl）對(duì)僧帽牡蠣（Ostrea cucullata）的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、硒依賴谷胱甘肽過氧化酶（SeGPx）活性的影響，旨在探究TBTCl對(duì)僧帽牡蠣抗氧化酶系統(tǒng)毒性的影響及致毒機(jī)制，以期為餐桌食品污染的防患、無(wú)公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)、環(huán)境檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1僧帽牡蠣。試驗(yàn)選用健康牡蠣，購(gòu)自泉州潯埔海鮮世界大型超市，體重25.69～38.12 g，貝高2.29～2.78 cm，貝寬4.13～4.86 cm，貝長(zhǎng)6.29～7.34 cm。試驗(yàn)前將購(gòu)買回來(lái)的牡蠣清除附著物，先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間12 h換水1次，并一次性充氧30 min。試驗(yàn)前選擇健康、反應(yīng)靈敏、大小基本一致的僧帽牡蠣隨機(jī)分組。試驗(yàn)期間不投喂餌料。

1.1.2試劑。牛血清白蛋白（上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品）、考馬斯亮藍(lán)G250（Fluka 產(chǎn)品）、鄰苯三酚（AR）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，AR）、鹽酸、85%磷酸、Na2HPO4·2H2O（AR）、KH2PO4（AR）、蒸餾水等。三丁基氯化錫（TBTCl），用無(wú)水乙醇溶解定容，配制母液10 μg/L，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)照濃度組為含0.05 ml/L乙醇的水體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1染毒處理。根據(jù)環(huán)境部門規(guī)定的允許濃度[10]及污染海域環(huán)境中有機(jī)錫質(zhì)量濃度[4]，設(shè)置對(duì)照組和5個(gè)濃度梯度試驗(yàn)組（1、2、5、10和100 ng/L），并且分別做3組平行試驗(yàn)。每個(gè)不銹鋼盆中放置30只僧帽牡蠣，充氣，記錄每組牡蠣的分泌物變化、活動(dòng)狀態(tài)，并及時(shí)撈出死亡牡蠣。每日更換相同濃度的污染液，試驗(yàn)期間水溫23～25 ℃，pH為7.8～7.9，鹽度為32‰～34‰。分別在染毒24、72和96 h 后取樣。

1.2.2粗酶液的提取。從各染毒組中分別隨機(jī)取出牡蠣樣品6只，去掉外殼取出軟組織，用蒸餾水沖洗其軟體組織數(shù)次，并用濾紙拭干后稱重、冰浴下快速活體解剖，分別取出消化腺和鰓，以8倍體積磷酸緩沖液冰浴勻漿，4 ℃離心（12 000 r/min，30 min），將上清液置于-80 ℃冰箱中保存，待測(cè)。

1.2.3測(cè)定指標(biāo)和測(cè)定方法。粗酶提取液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測(cè)定，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD含量[12]，采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性[13]，采用熒光分光光度法測(cè)定SeGPx活性[ 14]。

1.3數(shù)據(jù)處理結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E.）表示。采用方差分析方法分析三丁基氯化錫（TBTCl）污染引起的差異；采用Duncuns 法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析。使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，使用OriginPro 7.5繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1三丁基氯化錫（TBTCl）對(duì)僧帽牡蠣SOD活性的影響從圖1可以看出，在消化腺中SOD的活性與TBTCl濃度和暴污時(shí)間存在一定的時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系。在對(duì)照組中，SOD的活性在整個(gè)試驗(yàn)周期幾乎沒有變化。從整體趨勢(shì)上看，在1～100 ng/L TBTCl的脅迫范圍內(nèi)，僧帽牡蠣消化腺SOD活性隨脅迫濃度的增大呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)：在24 h內(nèi)，僧帽牡蠣經(jīng)低濃度（1 ng/L）的TBTCl脅迫，立即表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用；當(dāng)TBTC1濃度為5 ng/L時(shí)，出現(xiàn)并不明顯的抑制作用，而當(dāng)染毒物濃度達(dá)到10 ng/L時(shí)，抑制作用達(dá)到顯著差異（P<0.05），當(dāng)TBTC1濃度為100 ng/L時(shí)仍為顯著抑制作用，抑制率達(dá)44.8%。在72 h內(nèi)，變化趨勢(shì)與24 h類似，而當(dāng)TBTC1濃度到達(dá)5 ng/L時(shí)，僧帽牡蠣消化腺SOD活性回升，仍為抑制作用，但差異不顯著（P>0.05）；在100 ng/L高濃度TBTCl的脅迫下，SOD活性回復(fù)至對(duì)照組水平（P>0.05）。在96 h內(nèi)，低濃度TBTCl（1和2 ng/L）的脅迫下，僧帽牡蠣消化腺SOD活性受到誘導(dǎo)或抑制，差異不顯著（P>0.05），當(dāng)TBTC1濃度為5 ng/L時(shí)表現(xiàn)為顯著抑制作用（P<0.05）。在10和100 ng/L濃度的TBTCl脅迫下，其活性回復(fù)并高于對(duì)照組，達(dá)到最大值[（54.73±0.31）U/mg]。

注：同一時(shí)間內(nèi)不同小寫字母表示各組間SOD活性差異顯著（P<0.05）。

2.3三丁基氯化錫（TBTCl）對(duì)僧帽牡蠣SeGPx活性的影響從圖3可以看出，處理24 h各濃度組下的SeGPx活性均有不同程度上升，但沒有顯著差異（P>0.05）。1 ng/L濃度組消化腺SeGPx活性在整個(gè)污染試驗(yàn)過程中基本與對(duì)照組一致。處理72 h，2和5 ng/L濃度組活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05），呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。10、100 ng/L濃度組活性都達(dá)到最大值（P<0.05），96 h后活性小幅度下降，時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系不顯著（P>0.05）。消化腺SeGPx活性表現(xiàn)出隨著三丁基氯化錫濃度的增加而增加的劑量一效應(yīng)關(guān)系。

注：同一時(shí)間內(nèi)不同小寫字母表示各組間SeGPx活性差異顯著（P<0.05）。

3討論

3.1三丁基氯化錫（TBTCl）對(duì)僧帽牡蠣抗氧化酶活性的影響自McCord 和Fridovich 1969 年提出生物活性氧自由基傷害學(xué)說(shuō)后，該學(xué)說(shuō)被廣泛運(yùn)用于生物在環(huán)境脅迫下?lián)p傷機(jī)制的研究中。在正常條件下生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，生理濃度的氧自由基不僅不會(huì)危害生物體，反而能起到一些獨(dú)特的生理作用。在某些條件（如環(huán)境理化條件變化、病害、環(huán)境污染等），生物體中自由基可大量生成，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。生物體中存在用于清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，由抗氧化酶和小分子抗氧化物組成。SOD、CAT和SeGPx 是生物體中最主要的3種抗氧化酶。SOD 專一催化超氧陰離子，將其歧化為H2O2和O2，H2O2可被CAT 和 SeGPx 進(jìn)一步分解為H2O 和O2，從而阻止超氧陰離子轉(zhuǎn)化為活性更高的·OH，·OH 能以接近擴(kuò)散極限的速度與任何可氧化的分子發(fā)生反應(yīng)。由于SOD、CAT和GPx在清除氧自由基中的重要作用，它們活性的高低可間接反映出生物體內(nèi)氧自由基含量的變化。

有機(jī)錫TBTCl不是生物體的必需元素，對(duì)生物體完全無(wú)益，是有害金屬，也是重要的環(huán)境和工業(yè)毒物，在一定濃度下，亦能產(chǎn)生毒害作用。當(dāng)僧帽牡蠣處于低濃度TBTCl（1 ng/L）時(shí)，SOD、CAT和SeGPx活性上升，說(shuō)明低濃度的有機(jī)錫進(jìn)入僧帽牡蠣體內(nèi)，刺激機(jī)體產(chǎn)生自由基，從而開始誘導(dǎo)清除自由基的SOD、CAT和SeGPx的合成。當(dāng)僧帽牡蠣受更高濃度的TBTCl污染時(shí)，SOD、CAT和GSHPx活性變化都呈現(xiàn)出不同程度的時(shí)間劑量依賴關(guān)系。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，10 ng/L TBTCl的24 h脅迫下，消化腺中SOD和CAT活性被顯著抑制（P<0.05），僧帽牡蠣消化腺中包含肝組織，而肝是許多內(nèi)源性和外源性化合物代謝解毒的場(chǎng)所，而鰓是呼吸器官，幾乎沒有吞噬和解毒功能，因此鰓對(duì)TBTCl的敏感性比消化腺要低。隨著TBTC1濃度的增大，誘導(dǎo)程度不同，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”，機(jī)體的應(yīng)激系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)能被全面激活，以清除過量的自由基，使機(jī)體免受氧化傷害，從而表現(xiàn)為SOD活力有不同程度的變化。張紅霞等[15]在有機(jī)錫離子對(duì)日本蟳血淋巴抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）活力影響的研究表明，在低濃度有機(jī)錫離子TBTCl≤2 ng/L作用下，各處理組SOD 活力在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均呈激活狀態(tài)，而高濃度處理組（TBTCl ≥5 ng/L）SOD 活力在暫時(shí)下降后逐漸升高，與72 h變化趨勢(shì)一樣。96 h內(nèi)，在1～5 ng/L TBTCl低濃度的脅迫下，僧帽牡蠣SOD活性呈現(xiàn)先下降再顯著下降趨勢(shì)（P>0.05），表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)在高濃度10～100 ng/L TBTC1脅迫下，進(jìn)入體內(nèi)的TBTCl 增多，產(chǎn)生了大量的活性自由基，誘導(dǎo)SOD 活性不斷上升，且高于其他染毒組。

黃周英等[16]通過0.1、1和10 ng/L濃度三丁基錫（TBT）對(duì)文蛤鰓的抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化暴露試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除高濃度TBT（10 ng/L）暴露在早期對(duì)CAT活性產(chǎn)生抑制外，TBT暴露對(duì)CAT活性的作用主要為誘導(dǎo)效應(yīng)，環(huán)境水平的TBT暴露對(duì)文蛤產(chǎn)生明顯的氧化脅迫。該試驗(yàn)結(jié)果表明24、72、96 h內(nèi)不同濃度的三丁基氯化錫（TBTCl）脅迫下，除了10 ng/L三丁基氯化錫（TBTCl）中強(qiáng)度脅迫下，在24 h內(nèi)消化腺CAT活性表現(xiàn)為顯著抑制作用，72和96 h內(nèi)消化腺CAT活性回復(fù)到與空白對(duì)照無(wú)顯著差異的水平。三丁基氯化錫（TBTCl）處理僧帽牡蠣24 h 后，在10 ng/L濃度組與0 ng/L對(duì)照組CAT活性表現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸與0 ng/L對(duì)照組的CAT活性接近，出現(xiàn)這種效應(yīng)可能是由于短時(shí)間的污染物暴露使酶蛋白的失活所致，此后機(jī)體的應(yīng)激性恢復(fù)了CAT的代償性機(jī)能。1、2、5和100 ng/L濃度的三丁基氯化錫（TBTCl）都對(duì)僧帽牡蠣消化腺CAT活性產(chǎn)生不同程度的誘導(dǎo)作用，均在100 ng/L三丁基氯化錫（TBTCl）下，活性最大。這說(shuō)明在較低濃度的三丁基氯化錫（TBTCl）脅迫啟動(dòng)了機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)，因此消化腺內(nèi)的CAT活性升高。隨著TBTC1濃度的增大，誘導(dǎo)程度不同，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”，機(jī)體的應(yīng)激系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng)，能被全面激活，在自由基的誘導(dǎo)下，酶活力逐漸升高，以清除過量的自由基，使機(jī)體免受氧化傷害，從而表現(xiàn)為CAT活力有不同程度的升高[17]。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，在100 ng/L高濃度下，由于僧帽牡蠣機(jī)體內(nèi)CAT的代償性機(jī)能恢復(fù)，僧帽牡蠣內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的酶促反應(yīng)對(duì)活性氧清除之間可能存在較好的動(dòng)態(tài)平衡，因此在100 ng/L濃度組下CAT活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)作用，并達(dá)到最高值。

SeGPx的主要功能在于催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物，也能參與清除三丁基氯化錫代謝過程中產(chǎn)生的各類自由基。該試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著僧帽牡蠣體內(nèi)三丁基氯化錫含量的提高，Se–GPx活性普遍增加。這表明有機(jī)錫污染程度的加劇已經(jīng)引起氧化脅迫。SOD、CAT、SeGPx 在功能上是相關(guān)的[18]，但該試驗(yàn)研究結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)三者活性的平行變化。考慮到生物體中由SOD 催化的超氧陰離子歧化并不是H2O2的唯一來(lái)源，還可以來(lái)自于氨基酸或細(xì)胞色素P450 氧化酶的反應(yīng)，而SeGPx 的底物除了H2O2外還可以是有機(jī)過氧化物，SOD、CAT和SeGPx活性相關(guān)性不顯著也是可能的。

3.2海洋生物體內(nèi)有機(jī)錫的富集特點(diǎn)三丁基錫作為一種高效海洋殺生劑具有殺菌、殺微生物和殺蟲性能，其重要用途之一是用于船體涂層添加物，以防止粘附生物的增長(zhǎng)，但同時(shí)也對(duì)牡蠣等非目標(biāo)生物構(gòu)成威脅，能導(dǎo)致牡蠣生長(zhǎng)畸形及繁殖力衰退等現(xiàn)象，曾引起世界許多地方的牡蠣養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的損失。該試驗(yàn)表明，三丁基氯化錫濃度為2 ng/L時(shí)能對(duì)僧帽牡蠣淀粉酶和脂肪酶活性起到較強(qiáng)的刺激作用，且浮游生物對(duì)有機(jī)錫有明顯的富集作用，港口附近的浮游生物體內(nèi)有機(jī)錫濃度可達(dá)670～800 ng/g（干重）[19]，遠(yuǎn)高于環(huán)境濃度。軟體動(dòng)物體內(nèi)能夠累積較高濃度的有機(jī)錫。例如，貝類可以從環(huán)境中迅速吸收、富集有機(jī)錫。使體內(nèi)濃度達(dá)到22 ng/g（濕重），高于環(huán)境5 000～60 000 倍[20]。魚類體內(nèi)同樣能夠累積有機(jī)錫。Rabitto等[21]研究表明石斑魚在使用含有機(jī)錫飼料72 d后，體內(nèi)有機(jī)錫含量達(dá)到0.3 μg/ml。鳥類和哺乳動(dòng)物處于食物鏈的最頂端，體內(nèi)有機(jī)錫的富集可以達(dá)到相當(dāng)高的水平，海鴨肝臟中有機(jī)錫含量超過1 000 ng/g，寬吻海豚（Tursiops truncatus）肝臟中有機(jī)錫含量達(dá)到11 340 ng/g[19]。因此，必須加強(qiáng)養(yǎng)殖海區(qū)水質(zhì)檢測(cè)和管理。由于有機(jī)錫化合物會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生較大影響，1974年聯(lián)合國(guó)海洋污染防治公約就將有機(jī)錫列入優(yōu)先控制的灰名單。英國(guó)政府也制定并從1987年開始執(zhí)行有關(guān)限制有機(jī)錫使用的法規(guī)，有機(jī)錫環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從1986年20 ng/L提高為1988年的2 ng/L[22]。該試驗(yàn)結(jié)果表明TBTCl濃度為5 ng/L甚至1 ng/L時(shí)就會(huì)對(duì)僧帽牡蠣的抗氧化酶活性產(chǎn)生顯著影響，因此限制有機(jī)錫的排放以及制定嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。

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