2種PCR試劑盒定量檢測(cè)血清HBV DNA含量的比較

張繼萬(wàn)，周建麗，張曉芳，羅麗莎，王海濱

2種PCR試劑盒定量檢測(cè)血清HBV DNA含量的比較

張繼萬(wàn)，周建麗，張曉芳，羅麗莎，王海濱

目的探討AMPLIPREP-COBASTAQMAN法（羅氏COBAS法）和北京鑫諾美迪PCR-熒光探針“一管法”檢測(cè)血清HBV DNA含量的性能差異。方法采用2種方法同步檢測(cè)175例乙型肝炎患者血清樣本，并將黃疸、溶血和脂血標(biāo)本作為干擾樣本，分析2種方法的相關(guān)性、一致性和抗干擾性。取一已知定量為2.24×109IU/ml的標(biāo)本，用陰性血清做1+9（即1∶10）的稀釋，并依次稀釋至2.24×10 IU/ml，比較2種方法的線性范圍和靈敏性的差異。結(jié)果175份均有數(shù)值的標(biāo)本中，2種試劑檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2種試劑對(duì)黃疸、溶血和脂血標(biāo)本的定量值影響不大。對(duì)于HBV DNA＞1.70×108IU/m l的樣本，羅氏COBAS法結(jié)果只顯示＞1.70×108IU/m l，而“一管法”無(wú)須稀釋仍能準(zhǔn)確定量；對(duì)于HBVDNA＜1.00×102IU/m l的樣本，“一管法”僅能檢測(cè)到病毒，而羅氏COBAS法的穩(wěn)定性和線性更好。結(jié)論P(yáng)CR-熒光探針“一管法”與進(jìn)口羅氏COBAS法具有良好的一致性，且省時(shí)、省力，價(jià)格低廉，適合在我國(guó)推廣應(yīng)用。

DNA，病毒；乙型肝炎，慢性；試劑盒，診斷

全球約有20多億人既往感染過(guò)HBV，其中約3.5億為慢性HBV感染者[1]。我國(guó)是乙型肝炎（乙肝）大國(guó)，人群乙肝表面抗原陽(yáng)性率約7.18%，嚴(yán)重影響我國(guó)人口健康，因此切實(shí)提高乙肝臨床診療水平具有十分重要的意義[2]。由于發(fā)病人數(shù)眾多，結(jié)合國(guó)情尋找價(jià)廉而療效肯定的藥物以及能滿足臨床需求的檢測(cè)項(xiàng)目，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對(duì)進(jìn)口全自動(dòng)HBV DNA定量技術(shù)和國(guó)產(chǎn)“一管法”試劑盒的準(zhǔn)確性和靈敏性等指標(biāo)進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)2種方法在我國(guó)不同層次醫(yī)院應(yīng)用的地位，為臨床檢測(cè)項(xiàng)目的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料175份乙肝血清樣本來(lái)自于解放軍第三〇二醫(yī)院門診及住院患者，用2種方法同時(shí)檢測(cè)。

1.2 黃疸、溶血和脂血標(biāo)本的選擇與制備

1.2.1 對(duì)照樣本的選擇分別選擇HBV DNA含量為1.00×109IU/ml、1.00×106IU/ml和1.00×104IU/ml無(wú)黃疸、溶血和脂血的血清為對(duì)照樣本。采用無(wú)黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陰性血清為稀釋液，按照1┼4（即1∶5稀釋）比例制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照血清。

1.2.2 含黃疸、溶血和脂血干擾血清的制備選擇HBV DNA陰性的高黃疸（TBIL＞500μmol/L）、高脂血（TG＞5.5mmol/L）和全血凍融的標(biāo)本為稀釋液，分別對(duì)對(duì)照血清做1┼4稀釋，制備出含有黃疸、溶血和脂血的高、中、低拷貝的干擾標(biāo)本。

1.3 主要試劑和儀器采用羅氏AMPLIPREP-COBASTAQMAN法（以下簡(jiǎn)稱“羅氏COBAS法”）全自動(dòng)核酸提取和擴(kuò)增系統(tǒng)，檢測(cè)下限為20.00 IU/ml，以及北京鑫諾美迪PCR-熒光“一管法”，最低檢測(cè)下限為5.00×102IU/ml，采用上海宏石公司SLAN熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 HBV DNA定量檢測(cè)

1.4.1 羅氏COBAS法加1ml血清到樣本管，然后將磁珠、裂解液和洗液等試劑放入儀器中指定位置。當(dāng)DNA在高溫（80℃）洗脫后，儀器自動(dòng)將反應(yīng)液加入提取的核酸中。最后，在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4.2 “一管法”在PCR反應(yīng)管底分別加入3μl“核酸釋放劑”，然后加入3μl標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待檢樣本，吸打混勻，95℃靜置10min，加入35μl的PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS l7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以±s表示，2組間比較采用成組t檢驗(yàn)。組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種方法相關(guān)性比較在175份樣本中，對(duì)2種方法檢測(cè)HBV DNA定量＞5.00×102IU/m l的90份進(jìn)行相關(guān)分析，二者的相關(guān)系數(shù)為0.948（圖1）。

圖1 羅氏COBAS法和“一管法”HBV DNA定量相關(guān)性比較Figure 1 Com parison of the correlation of HBV DNA quantification by Roche COBAS TaqM an HBV assay and one-tube nested PCR assay

2.2 2種方法一致性比較按目前臨床通用臨界值5.00×102IU/m l進(jìn)行2種方法的一致性分析，＞5.00×102IU/ml的標(biāo)本為陽(yáng)性，＜5.00×102IU/ml的標(biāo)本為陰性。在175份血清樣本中，2種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的標(biāo)本有90份，均為陰性的標(biāo)本有76份。二者陽(yáng)性符合率為94.74%，陰性符合率為95.00%，粗一致性為94.85%（表1）。

表1 2種方法一致性比較(份)Table 1 Comparison of the consistency between the two assay methods（sam ples）

2.3 2種方法定量范圍和靈敏性比較選取1份HBV DNA定量＞1.00×109IU/ml的強(qiáng)陽(yáng)性樣本（經(jīng)HBV核酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品定值），用陰性血清做1┼9（即1∶10）的稀釋，然后用2種方法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，對(duì)于濃度為1.00×102IU/m l～1.70×108IU/ml的樣本，2種試劑的定量結(jié)果與理論靶值均具有良好的一致性，二者的平均值與理論濃度的對(duì)數(shù)線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 5和0.999 4；對(duì)于＜1.00×102IU/ml的樣本，“一管法”能檢測(cè)到病毒，但定量值不再呈10倍遞減，羅氏COBAS法仍呈10倍遞減；對(duì)于＞1.70×108IU/ml的樣本，羅氏COBAS法結(jié)果只顯示＞1.70×108IU/ml（若要精確的定量值，須稀釋后再做），“一管法”仍呈10倍遞增，可準(zhǔn)確定量HBV DNA含量高于8個(gè)數(shù)量級(jí)以上的臨床樣本，而無(wú)須稀釋（表2、圖2）。

表2 2種試劑檢測(cè)梯度稀釋樣本定量結(jié)果比較(IU/m l)Table 2 Comparison of HBV DNA quantification between the two assay methods（IU/m l）

2.4 2種方法檢測(cè)黃疸、溶血和脂血標(biāo)本的結(jié)果比較含有黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)2種不同核酸提取方法進(jìn)行的熒光PCR結(jié)果都產(chǎn)生不同程度的影響。黃疸標(biāo)本對(duì)“一管法”的擴(kuò)增效率產(chǎn)生的影響最大，脂血標(biāo)本影響最?。▓D3）。含有黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)熒光PCR定量結(jié)果影響不大，因其Ct值僅有細(xì)微差別。

3 討論

我國(guó)在全球范圍內(nèi)首先將HBV DNA定量指標(biāo)列為臨床抗病毒治療的參考指標(biāo)，在乙肝抗病毒治療方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)[3-6]。核苷（酸）類似物等抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，可降低患者的血清病毒含量，因此臨床對(duì)HBV DNA檢測(cè)的靈敏性要求越來(lái)越高[7-10]。近幾年國(guó)產(chǎn)試劑盒的質(zhì)量一直穩(wěn)步提升，其檢測(cè)靈敏度也由5年前的＜1.00×103IU/ml，提升到1.00×102～5.00×102IU/ml，并且檢測(cè)結(jié)果與國(guó)際通用技術(shù)具有一定的可比性。羅氏COBAS法在檢測(cè)中使用的血清量為500μl，而“一管法”僅使用3μl，因此有前者的靈敏度要高于后者166.7（500/3）倍的視覺(jué)，但在實(shí)際研究中并未發(fā)現(xiàn)這樣的差異[11-13]。研究表明，血清量的增加除了能提高視覺(jué)上的靈敏度外，還存在被大家忽視的PCR干擾物質(zhì)如蛋白及離子等呈倍數(shù)增加[14]，而且核酸提取過(guò)程中核酸丟失的問(wèn)題亦容易被忽略。研究指出，磁珠的核酸丟失可高達(dá)90%以上[15]?！耙还芊ā敝苯訉?μl血清加入PCR反應(yīng)管中，經(jīng)過(guò)蛋白溫度變性處理即進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3μl之所以可對(duì)5.00× 102IU/ml（約3×103copies/ml）的血清標(biāo)本進(jìn)行定量，一則無(wú)核酸丟失，二則其理論靈敏度為50 IU/ml（約3×102copies/ml），完全可滿足目前臨床檢測(cè)需求。

圖2 “一管法”10倍梯度稀釋擴(kuò)增曲線Figure 2 Am plification curves for 10-fold dilution series by one-tube nested PCR assay

圖3 “一管法”提取高、中、低拷貝干擾血清的擴(kuò)增曲線Figure 3 Amp lification curves for high,medium and low levels of HBV DNA in interference sera by one-tube nested PCR assay

本文對(duì)175份血清標(biāo)本進(jìn)行研究的結(jié)果提示，二者均具有良好的相關(guān)性、較好的一致性和優(yōu)秀的抗干擾性能。羅氏COBAS法有5項(xiàng)標(biāo)本定量為＞5.00×102IU/ml，而“一管法”定量為＜5.00× 102IU/ml；反之，“一管法”有4項(xiàng)標(biāo)本定量為＞5.00×102IU/m l，羅氏COBAS法定量為＜5.00× 102IU/ml。重復(fù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這9份標(biāo)本全部為臨界值。因此對(duì)臨床需求的5.00×102～1.00×108IU/m l的標(biāo)本而言，2種方法均能準(zhǔn)確滿足。對(duì)HBV DNA含量＞1.00×108IU/ml的血清標(biāo)本，“一管法”可無(wú)須稀釋標(biāo)本即可提供準(zhǔn)確結(jié)果，羅氏COBAS法卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)，而臨床對(duì)高次方標(biāo)本的HBV DNA需求并不十分強(qiáng)烈。羅氏COBAS法的優(yōu)勢(shì)是對(duì)HBV DNA含量＜5.00×102IU/m l的標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確定量，其定量靈敏度高達(dá)20.00 IU/ml。按2005年專家共識(shí)的要求，建議對(duì)血清HBV DNA含量＞2.00×104IU/ml的患者行核苷類似物治療[16]。因此具有較高靈敏度的試劑盒臨床使用價(jià)值并不高，但因臨床醫(yī)生和患者對(duì)治療結(jié)果的“挑剔”，提高試劑盒的靈敏度符合現(xiàn)實(shí)需求。

“一管法”病原體核酸熒光定量PCR檢測(cè)法與羅氏COBAS法相比，除了價(jià)格低，耗時(shí)短外，還具有抗干擾性能良好，高含量HBV DNA標(biāo)本無(wú)須稀釋，操作簡(jiǎn)便，污染概率低等優(yōu)勢(shì)。雖然低拷貝樣本中的穩(wěn)定性及線性欠佳，但結(jié)合我國(guó)國(guó)情，適合臨床檢測(cè)，值得推廣。

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（2014-05-11收稿 2014-06-27修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 陳玉琪）

Comparison of two PCR assays for serum HBV DNA quantification

ZHANG Ji-wan,ZHOU Jian-li,ZHANG Xiao-fang,LUO Li-sha,WANG Hai-bin*
Department of Infectious Diseases,Sichuan Provincial Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces,Leshan,Sichun 614000,China
*Corresponding author,E-mail:haibin_wang@sohu.com

Objective To investigate the performance differences in detecting serum HBV DNA quantification between Roche COBASTaqMan HBV assay and one-tube nested PCR assay.Methods The serum samples from 175 patientswith hepatitis B were detected by Roche COBASTaqMan HBV assay and one-tube nested PCR assay,with the jaundice,hemolytic and lipemic samples as interference samples,so as to analyze the correlation,consistency and interference performance of the two assays.A known sample with 2.24×109IU/ml of HBV DNA was diluted by 1∶10 in negative serum in turn,and finally to an HBV DNA level of 2.24×10 IU/ m l.The linear range and sensitivity of the two assays were analyzed.Results There was no significant difference in HBV DNA quantification of the 175 samples detected by the two assays.HBV DNA quantification in the jaundice,hemolytic and lipemic samples detected by the two assays was not significantly different.For samples with HBV DNA＞1.70×108IU/ml,Roche COBAS TaqMan HBV assay only showed HBV DNA level of＞1.70×108IU/m l,but HBV DNA could be accurately quantified without being diluted by one-tube nested PCR assay.For sampleswith HBV DNA＜1.00×102IU/ml,one-tube nested PCR assay could only detect the virus,but Roche COBASTaqMan HBV assay had better stability and linearity.Conclusions The detection result of HBV DNA quantification by one-tube nested PCR assay is consistent with that by Roche COBAS TaqMan HBV assay,and one-tube nested PCR assay,as a timesaving,laborsaving,and cheap method for quantifying HBV DNA levels,is suitable for application in China.

DNA,viral;hepatitis B,chronic;reagent kits,diagnostic

R342.4；R512.62

A

1007-8134(2014)04-0219-04

軍隊(duì)“十二五”面上課題（CWJ11J298）

614000樂(lè)山，武警四川省總隊(duì)醫(yī)院傳染科（張繼萬(wàn)、周建麗、張曉芳、羅麗莎）；100039北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（王海濱）

王海濱，E-mail:haibin_wang@sohu.com