動物胚胎發(fā)育中的MicroRNAs研究進展

吳偉偉，宮 平，哈尼克孜，石曉雷，于麗娟，田月珍，田可川

（新疆畜牧科學院畜牧科學研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

動物胚胎發(fā)育中的MicroRNAs研究進展

吳偉偉，宮 平，哈尼克孜，石曉雷，于麗娟，田月珍，田可川*

（新疆畜牧科學院畜牧科學研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

MicroRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼RNA，具有調(diào)控功能，長度約有20～25個核苷酸，它通過與靶基因特異性的堿基配對引起靶基因的降解或者抑制其翻譯，從而實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控。文章綜述了miRNA的發(fā)現(xiàn)、體內(nèi)生成機制、作用機制及不同動物種類胚胎發(fā)育過程中miRNA的鑒定和研究，并并闡述了miRNA研究中的問題及應用前景。

miRNA；動物；胚胎發(fā)育；

microRNAs（miRNAs）首先是指非編碼RNA，它具有調(diào)控功能，且屬于內(nèi)源性，發(fā)現(xiàn)于真核生物中，這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，調(diào)節(jié)基因表達的方式多是斷裂靶標mRNAs或抑制翻譯水平，這類miRNA長度較小，約有20～25個核苷酸。一部分特異的核酸酶通過剪切加工那些長的初級轉(zhuǎn)錄物就產(chǎn)生了成熟的miRNAs，再與RNA誘導產(chǎn)生的沉默復合體組裝，運用堿基互補配對的原理對靶mRNA進行識別，而指導復合體阻遏mRNA的翻譯或降解靶mRNA則取決于其互補程度的差異。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA涉及多個調(diào)節(jié)途徑，如細胞的增值與凋亡、脂肪的生成代謝、組織器官的形成、造血功能、病毒防御及機體的發(fā)育等等。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

20世紀90年代，一種存在于線蟲體內(nèi)的不編碼蛋白的RNA（lin-4）被lee等人發(fā)現(xiàn)[1]，這種RNA可生成一對比較小的RNA轉(zhuǎn)錄本，兩個轉(zhuǎn)錄本都能調(diào)節(jié)線蟲幼蟲的生長發(fā)育情況，其調(diào)節(jié)方式是在翻譯時抑制核蛋白lin-14的表達。研究人員推測可能是lin-4的部分序列與基因lin-14的mRNA的3'UTR區(qū)特異性的重復序列存在的序列互補導致了這一現(xiàn)象的產(chǎn)生。研究人員發(fā)現(xiàn)啟動發(fā)育幼蟲第二階段的條件是在第一階段的末期降低lin-14的表達，在經(jīng)過七年的研究后，人們找到了另一個miRNA，即let-7，其也能對線蟲的生長發(fā)育進行條件，類似于lin-4。let-7發(fā)現(xiàn)以后，研究人員在許多生物體中發(fā)現(xiàn)了miRNAs，主要采用的方式是生物信息學預測及隨機克隆和測序。這些被發(fā)現(xiàn)的miRNAs被Sanger研究所主辦的miRBase網(wǎng)站進行整理注釋后公布于眾，見圖1。

圖1 miRNA的生物起源

miRNAs多為長度為21-25nt的雙鏈RNA分子，其具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)且起源于內(nèi)源性表達轉(zhuǎn)錄本。microRNAs（miRNAs）是一種小的由高等真核生物的基因組編碼的類似于siRNA的分子，其控制沉默復合體阻遏mRNA翻譯或降解mRNA的方式是運用堿基互補配對的原理對靶mRNA進行配對。miRNAs的表達只存在于某些特殊的組織及發(fā)育階段，可見其保守的物種進化過程，而組織和細胞的特異性功能則取決于miRNA的組織特異性和時序性，證實miRNA調(diào)節(jié)細胞生長和發(fā)育的多樣性[2]。

2012年8月1日，SangermicroRNA序列數(shù)據(jù)庫 (miRBase)升級至19.0版。與以往的數(shù)據(jù)庫相比，miRBase19.0更新了大量數(shù)據(jù)；miRNA發(fā)夾前體序列新增3171條，總數(shù)升至21264條；成熟miRNA新增3625條，總數(shù)升至25141條；miRBase19.0版報道的所有物種新增25個，總數(shù)升至193個。并且新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名法進行了系統(tǒng)的修正，徹底取消了miR*命名法，而以-5p和-3p的命名法取代之。牛目前有766條前體序列，755條成熟miRNA。綿羊有55條前體序列，103條成熟miRNA。豬有271條前體序列，306條成熟miRNA。見表1、圖2。

表1 miRbase19.0新增物種列表

圖2miRBase數(shù)據(jù)庫相關信息Fig2.TheinformationofmiRBasedatabase

2 miRNA的體內(nèi)生成機制

定位于生物體基因組上的miRNA編碼基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和加工可獲得成熟miRNA?？茖W家估算認為大約有720種miRNA編碼基因存在于人類基因組中，其中的30%包含在蛋白編碼基因的內(nèi)含子中，剩余的70%則位于基因的間隔區(qū)。大部分的miRNA編碼基因是從和宿主蛋白基因共同轉(zhuǎn)錄的基因的內(nèi)含子中剪切出的，但也有存在于單獨的轉(zhuǎn)錄單位中的miRNA，不過大多產(chǎn)生于包含miRNA簇的轉(zhuǎn)錄本或蛋白編碼基因的基因內(nèi)序列。前人研究認為miRNA的生物發(fā)生經(jīng)歷了一個比較復雜的過程：pri-miRNA—pre-miRNA—miRNA雙鏈體 (miRNA：miRNA*)—成熟miRNA—特異性結(jié)合到RNA誘導沉默復合物(RISC)等[3]。 見圖3。

圖3miRNAs的生物學發(fā)生和功能Fig3.ThebiogenesisandfunctionofmiRNAs

(A)miRNAs編碼基因轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）：在細胞核開始發(fā)生miRNA序列。Bartel[4]和Kim[5]研究表明RNA聚合酶II調(diào)控基因啟動了大部分的miRNA的轉(zhuǎn)錄過程。miRNA基因首先在RNA聚合酶II的促進下轉(zhuǎn)錄生成一個長的初級轉(zhuǎn)錄本，而在這個初級轉(zhuǎn)錄本中包含一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)及成熟miRNA。在初級轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄成功后，這些初級轉(zhuǎn)錄本由于存在不完全互補序列可以生成二級結(jié)構(gòu)復合物，最后經(jīng)過折疊后定位于細胞核。為了方便而后產(chǎn)生的miRNA前體進行剪切，首先要對初級轉(zhuǎn)錄本進行初步加工，而對于如何加工的研究則不多。通過研究線蟲的let-7miRNA，我們發(fā)現(xiàn)其5′端存在剪接引導序列，而這些序列正是反式剪接的底物。初級轉(zhuǎn)錄本的反式剪接對產(chǎn)生成熟let-7RNA具有非常重要的影響，其具有延長發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端的莖區(qū)的作用，從而使RNA聚合酶ⅢDrosha的底物暴露出來，剪除影響下一步剪切的序列。

(B)pri-miRNA剪切產(chǎn)生前體miRNA（pre-miRNA）：在miRNA雙鏈的RNA區(qū)域被稱為“微處理器”（microprocessor）的復合物識別之前，首先需要折疊成發(fā)夾環(huán)，然后再被較長的轉(zhuǎn)錄本切割成大約70nt的發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體[6-9]。RNASEN(DROSHA)與DGCR8組成“微處理器”復合物。

(C)miRNA前體從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)出：位于細胞質(zhì)內(nèi)的Dicer酶需要對動物的pre-miRNAs進行深一步的加工。Yi等[10]報道前體miRNA從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)是依靠于RanGTP/exportin5的轉(zhuǎn)運機制。首先是exportin5促使前體miRNA從Drosha復合體中釋放出來，并和其結(jié)合，但這必須在RanGTP具有高濃度的情況下才能進行，結(jié)合后前體miRNA被帶入至細胞質(zhì)內(nèi)。進入胞質(zhì)后，RanGTP的濃度會有所降低，此時前體miRNA從exportin5中脫離與Dicer酶結(jié)合開始下一步的加工。

(D)miRNA：miRNA*雙鏈體的形成：前體miRNA在進入胞質(zhì)后即會結(jié)合第二個雙鏈特異性RNAse III，但前提是這個RNAseIII必須含有酶復合物。DICER1組件存在于這些酶復合物中，此組件可以識別dsRNA，再從pre-miRNA的非環(huán)末端切割約2個螺旋或22bp，然后移去環(huán)形成較小的雙鏈RNA[11]。

(E)miRNA的成熟：DICER1-bounddsRNA與RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)快速結(jié)合，再通過與RISC互作展開雙鏈小RNA，進而生成成熟miRNA[5,12,13]。post-DICER1dsRNA的熱力學性質(zhì)決定了雙鏈體的哪條鏈條被降解或形成成熟miRNA[14,15]。miRNA由于其在堿基配對上穩(wěn)定性較差在加工的時候就被加載到RISC上。miRNA首先被加載到復合物中，在 “種子”序列的作用下與堿基配對，與RISC mRNA轉(zhuǎn)錄本3′非翻譯區(qū)中的特定結(jié)合位點進行靶作用。“種子”序列即seedsequence，決定了miRNA與mRNA的結(jié)合，其大概有7-8nt的序列，位于成熟miRNA的上。RISC是介導miRNA基因沉默和miRNA：mRNA互作所必須的一種核糖核蛋白復合物。目前已發(fā)現(xiàn)RISC組件是由TRBP、Argonaute蛋白和Dicer組成的，其中最受關注的是Argonaute蛋白和核糖核酸酶Dicer。 RISC中的一個非常重要的功能元件是Aargonaute蛋白，其發(fā)揮的功效主要是作為內(nèi)源性切割的催化元件。在miRNA發(fā)生中發(fā)揮核糖核酸酶作用的是Dicer，主要功效是釋放成熟miRNA雙體。

3 miRNA作用機制

miRNA主要調(diào)控真核生物基因表達的轉(zhuǎn)錄，是一種較新的基因表達調(diào)控因子，其具有非蛋白質(zhì)性質(zhì)。目前在miRNA調(diào)控基因領域的研究熱點是其表達研究機制?，F(xiàn)在存在的關于miRNA調(diào)控基因表達機制的理論假說模型有重激活、去阻遏、SG顆?？垩喊衜RNA、mRNA降解、P小體、翻譯起始抑制和起始后抑制等[3]。

3.1 miRNA抑制翻譯的起始

在含有m′Gppp具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA帽子，含有內(nèi)部核糖體進入位點和含有ApppN帽子結(jié)構(gòu)的三種mRNA，只有miRNA可以抑制m′Qppp帽子結(jié)構(gòu)；而且，核糖核蛋白復合體中聚集了某些帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白或者miRNA翻譯起始過程中，干擾真核翻譯起始因子（enkaryotictranslationinitiationfactors）eIF4G相互作用的蛋白質(zhì)，進而導致翻譯起始復合物不能與40s核糖體小亞基進行結(jié)合。另外：AGO（Argonautc）蛋白由于具有eIF4G帽子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源結(jié)構(gòu)序列，從而可以阻止eIF4G生成起始復合物。抑制存在三個模型：一個模型結(jié)合了miRNA5'帽子結(jié)構(gòu)上mi-RISC和e-IF4E之間的競爭；另一個模型是mi-RISC促進m-RNApoly3'尾巴的脫腺苷化；第三個模型是mi-RISC阻止60s核糖體單位與40s的翻譯起始復合體的結(jié)合。mi-RISC介導的e-IF6，阻止核糖亞單位的起始位點結(jié)合來抑制翻譯。miRNA及其靶標與多核糖共沉淀，可抑制內(nèi)部核糖體進入位點，啟動非依賴性的帽子翻譯。

3.2 miRNA的起始后抑制

開始在線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4的靶基因lin-14和lin-18的mRNA在結(jié)合lin-4前后，經(jīng)蔗糖梯度和甲泛葡胺密度梯度，離心其密度未發(fā)生改變，實際上是lin-14和lin-18的miRNA在與lin-4結(jié)合后仍與多核糖體相偶連，翻譯開始后才產(chǎn)生抑制作用。多聚核糖體與miRNA及其標靶結(jié)合于蔗糖沉降梯度中。多聚核糖體之所以能夠翻譯miRNA標靶是由于它們對抑制翻譯的條件比較敏感。比如，一些翻譯抑制劑與多聚核糖體經(jīng)過短暫的保溫，這些抑制劑如嘌呤霉素、多羥基瑙醇或密旋霉素，之后多聚核糖體可形成核糖體亞基或核糖體單體[16-19]。miRNA還可以結(jié)合基因的編碼區(qū)和5′UTR區(qū)。miRNA通過與靶細胞的啟動子和5′UTR區(qū)結(jié)合來啟動一些基因的表達。如miRNA-373與E-鈣黏蛋白和含冷激域的蛋白質(zhì)C2的啟動子區(qū)域結(jié)合上調(diào)了靶基因的表達。

人們針對miRNA標靶被成功翻譯但無對應的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這一矛盾現(xiàn)象提出了多肽鏈在翻譯的同時降解的假說。但是這種假說并沒有被正面證據(jù)所證實，如人們?nèi)圆幻鞔_假定的蛋白酶的性質(zhì)。由于沉默的mRNA蛋白質(zhì)表達無法被蛋白酶體抑制劑恢復，所以我們可以排除存在蛋白酶體參與[18]。

Petersen等[19]人為了獲得miRNA沉默標靶的機制，設計出一個包含3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的合成的miRNA用于報告mRNA，而6個可以轉(zhuǎn)染與miRNA類似的siRNA部分互補的相同位點存在于這個3′非翻譯區(qū)上。雖然siRNA抑制mRNA的瞬時表達，但多聚核糖體依然可以和報告mRNA結(jié)合。在翻譯起始受抑制的核糖體的解離速度要高于未受抑制的核糖體。這樣便形成了一個miRNA可引起核糖體提前解離或脫落的假說。

還有其他一些證據(jù)表明miRNA對翻譯起始后的抑制：通過含有內(nèi)部核糖體進入位點 (IRES)的5’UTR啟動的報告mRNA的進行翻譯時一樣產(chǎn)生沉默。由于mRNA帽結(jié)構(gòu)與被IRES啟動的mRNA的翻譯無關，進一步證實了miRNA對翻譯的抑制發(fā)生于帽識別之后的階段[20]。

3.3 miRNA介導的mRNA降解與P小體有關

由于miRNA的脫腺苷化，去帽子和核苷酸內(nèi)切酶的消化，使得miRNA降解。同時也發(fā)現(xiàn)Ago（Argonautc）蛋白定位于降解miRNA的RNA的顆粒。利用RNA顆粒含有的降解酶使其降解。

P小體是一種RNA顆粒體，且存在于真核細胞細胞質(zhì)中，包含有大量的mRNA的降解蛋白和翻譯抑制子，當mRNA的翻譯受到抑制時，P小體會出現(xiàn)體積和數(shù)量上的變化，但此過程并非不可逆，受到翻譯抑制的mRNA只是暫時停留在P小體。當出現(xiàn)環(huán)境變化時，mRNA返回到細胞質(zhì)中，結(jié)合核糖體合成蛋白質(zhì)，P小體包含AGO（Argonautc）蛋白和GW182抗體等參與miRNA轉(zhuǎn)錄沉默子的蛋白。這些蛋白引導miRNA與P小體中的蛋白結(jié)合，從而抑制靶細胞的翻譯。如肝特異性miRNA-122沉默肝細胞中的GAT1mRNA，在P小體中隨機聚集，在應激狀概況下，可以通過促進miRISC-靶mRNA復合體解離和P小體解聚，去除miRNA的抑制作用，從細胞核進入到細胞質(zhì)中，與GAT1的3UTR區(qū)結(jié)合，從而使P小體釋放出GAT1mRNA，進入核糖體開始翻譯。

4 動物胚胎miRNA的鑒定和研究

4.1 對斑馬魚胚胎的研究

斑馬魚（Daniorerio）由于其具有水生脊椎動物的顯著特征，一直被作為常用模式動物用于研究現(xiàn)代遺傳學、發(fā)育生物學及細胞生物學等[21]。生物信息學預測認為，斑馬魚基因組可能至少可以編碼400種miRNAs[22]。研究人員在對斑馬魚不同發(fā)育階段的小RNA文庫構(gòu)建研究后發(fā)現(xiàn)其已有217個miRNAs[22]，并已經(jīng)掌握了部分miRNAs的功能機制。下面將具體闡述miRNAs對斑馬魚的發(fā)育調(diào)控機制。

把用于加工成熟miRNAs的Dicer酶進行基因突變可以為我們展現(xiàn)斑馬魚胚胎發(fā)育中miRNAs所起的作用[23]。由于斑馬魚在早起卵裂到中囊胚期之前的胚胎發(fā)育是受母源性基因的調(diào)控[24]，所以Ciruna[25]和Giraldez[26]等進行了一些方法以排除受到母源性基因的影響。他們將正常斑馬魚胚胎中的生殖細胞替換成結(jié)合了Dicer突變的生殖細胞，已經(jīng)發(fā)生Dicer突變的生殖細胞會出現(xiàn)于這些被替換后仍能正常發(fā)育的斑馬魚個體中。

配子在突變后進行受精而后產(chǎn)生的胚胎發(fā)育時不能產(chǎn)生成熟的miRNAs，這一點可用于研究在斑馬魚胚胎發(fā)育中缺失miRNAs會發(fā)生何種變化。神經(jīng)胚的形成也會受到Dicer突變的重要影響。產(chǎn)生實心的棒狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)管的原因是神經(jīng)板到神經(jīng)管的發(fā)育過程中出現(xiàn)異常。不僅視網(wǎng)膜的發(fā)育會受到Dicer的影響，脊髓發(fā)育也受到Dicer突變的干擾，如神經(jīng)底板的降低，神經(jīng)官腔的缺少及腦室數(shù)的減少等。雖然神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育已出現(xiàn)畸形，但通過分析基因的表達我們觀察到一些圖示如神經(jīng)管的背-腹軸和前-后軸并未受到徹底的破壞，以此可發(fā)現(xiàn)還未破壞胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的圖示，可見miRNAs對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的圖式形成及命運決定過程影響較小，Dicer酶對神經(jīng)細胞的分化及腦正常發(fā)育起著十分重要的作用。研究人員認為斑馬魚胚胎的早期發(fā)育受某些miRNAs的影響的一個佐證是斑馬魚腦和原腸胚發(fā)育出現(xiàn)缺陷是由Dicer突變引起的[26]。

Giaraldez等[26]利用報告基因GFP研究發(fā)現(xiàn)當胚胎外包達到二分之一時miRNA-430家族才開始表達，而后當開始形成原腸胚和體節(jié)時繼續(xù)表達，表達在發(fā)育2d后下降。在Dicer突變胚胎中注射合成的mi-430雙鏈核苷酸則能降低腦和原腸胚的異常發(fā)育情況。Lim[27]等研究預測了miRNA-430的靶基因情況，發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控不止一個靶基因的表達，當早期胚胎對母源mRNA脫腺苷化及清除有促進作用。

在斑馬魚腦中另一個表達豐富的miRNA是miRNA-125b，它通過對P53mRNA的3′UTR的直接作用進而抑制P53蛋白的表達。對斑馬魚胚胎進行r射線和喜樹堿處理可快速增加P53的蛋白水平，進而可引起斑馬魚腦細胞的大面積凋亡[28]。這些都表明了在斑馬魚腦部發(fā)育中miRNA-125b所起到的重要作用。

對斑馬魚腸的發(fā)育和成熟起到關鍵作用的是miRNA-145，因為其可以調(diào)控腸平滑肌的發(fā)育。當miRNA-145的表達受到抑制時，腸平滑肌和上皮細胞的發(fā)育將不完全，導致堿性磷酸酶完全不能表達，從而使腸平滑肌的功能得不到發(fā)揮[29]。

另外在斑馬魚的心室的形成過程中不可缺少的miRNA是miRNA-143，其主要功能是直接抑制F-action加帽蛋白基因Adducin3的表達。當miRNA-143被敲出時，心室肌肉F-action的重構(gòu)將被抑制，進而引起心室塌陷導致心室收縮力下降?？梢娦氖倚纬蛇^程中miRNA-143對Adducin3基因表達調(diào)控的重要性[30]。

4.2 鼠胚胎方面的研究

采用miRNA擴增結(jié)合miRNA芯片技術(shù)，篩選在小鼠受精后1.5d(2細胞)和2.5d(4細胞)胚胎中差異表達的microRNA。在對MicroRNA芯片數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)miRNA的表達有192個(2倍)出現(xiàn)了顯著差異，在4細胞時表達比2細胞明顯上調(diào)的miRNA有122個，明顯下調(diào)的miRNA有70個。這次的miRNA表達變化是在胚胎基因組激活之后，通過分析這些差異的表達水平和功能，我們發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中有些與發(fā)育相關的重要基因可能受到miRNA的調(diào)控，可見miRNA在胚胎發(fā)育中所產(chǎn)生的作用重大，而這些對我們進一步研究發(fā)現(xiàn)阻滯胚胎發(fā)育的分子機制有著非常重大的意義[31]。

miR-34c在性成熟小鼠（1個月）睪丸中表達量最高，且只在生精細胞中高表達，其次為成熟睪丸，在睪丸中表達量少的階段主要在胚胎期及和出生至到性成熟之前，另外其在卵巢組織中的表達也很低；這些現(xiàn)象都說明該miRNA為睪丸生精細胞特異且高度表達[32]。合成miR-34c模擬物，觀察分析小鼠胚胎干細胞誘導分化雄性生殖時所到的此miRNA的影響。研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-34c的mESCs，經(jīng)RA誘導48h后，AP陽性克隆的結(jié)果表明，c-Myc、0ct4等一些多能性相關基因表達下降明顯，而Scp3、Vasa等一些生殖相關基因表達大幅度上調(diào)。初步揭示，小鼠胚胎干細胞在向生殖細胞誘導分化時受到miR-34c作用。miR-34c可作用于RARg（RA的Y亞體受體）基因的3′UTR，從而可能調(diào)控雄性生殖細胞的發(fā)生過程，特別是調(diào)控生殖細胞的減數(shù)分裂過程。以上說明，miR-34c可能與哺乳動物雄性生殖系統(tǒng)有著密切的關系，其對mESCs向雄性生殖細胞分化起著十分重要的作用。

4.3 豬胚胎方面的研究

Li等[33]采集了豬從胚胎期到180日齡10個發(fā)育階段的完整胚胎或富有代表性的不同組織類型來構(gòu)建miRNA文庫，利用Solexa測序技術(shù)對10個miRNA文庫進行序列測定，結(jié)果共檢測到995個miRNA，對應862個Pre-miRNA，uniquemiRNA序列有771個，同時還發(fā)現(xiàn)高表達的miRNA主要是以isomiR的形式進行表達，isomiR和miRNA*增加了miRNA對基因調(diào)控的復雜性。發(fā)現(xiàn)miRNA的let-7家簇和mi-R-122分別有50個、29個成員。Let-7家族有高度的保守性。尤其在30胚齡和45胚齡的早期發(fā)育階段[34]。8種豬特異性的miRNA在這10個文庫中共表達。

Zhou等[35]以豬 33d的胚胎（E33）為研究對象，利用 Solexa高通量測序技術(shù)鑒定豬胚胎頭部與內(nèi)臟的miRNA在頭部文庫中共識別出候選miRNA194種，已知miRNA75種；而在內(nèi)臟文庫中識別出候選miRNA130種，已知miRNA76種，在兩個器官組織中表達量最高的分別為miR-9和miR-1。在成年豬的肌肉、肺臟和大腦中表達量最高的分別是miR-1、miR-103和miR-140*。選取了50種靶基因，KEGG Pathway分析表明這些靶基因參與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)、四肢、前后模式、背腹模式的形成。

4.4 雞胚胎方面的研究

以往研究發(fā)現(xiàn)，雞的基因組中含有大量的miRNA。Glazov等[37]采用Solexa高通量測序研究發(fā)育第5 d、7d、9d雞胚胎，發(fā)現(xiàn)了449個新的miRNA，其中的很多在不同的時間點有不同的表達模式。Damell利用原位雜交法分析研究對雞胚胎發(fā)育早期miRNA的表達情況，研究表明在胚胎發(fā)育的前5d約有100個miRNA進行表達，而這期間表達的miRNA大部分都有組織表達特異性的特點[38,39]。HickS等[78]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在雞胚胎發(fā)育的第11d有近200個miRNA開始表達，而法氏囊和脾臟中的miRNA表達量在第15d和20d會出現(xiàn)顯著的差異，在發(fā)育的第15d和20dnc-miR-21在法氏囊中不表達卻在脾臟中表達較高，而同源的miR-148b卻出現(xiàn)了相反的情況。

4.5 家蠶卵方面的研究

Yu等[36]在家蠶14個發(fā)育時期的miRNAs進行分析研究，結(jié)果表明miRNA在家蠶四齡蛻皮期的表達數(shù)量和種類遠高于家蠶其他發(fā)育期，進一步利用Stem-loopRT-PCR分析表明，在四齡蛻皮期表達變化差異較大的是一些保守miRNA，說明miRNA對這一時期的調(diào)控作用比較重大。研究人員進一步分析了15個保守的家蠶miRNAs的表達量，結(jié)果表明在不同發(fā)育時期表達量變化顯著的miRNAs有8個，結(jié)合家蠶的發(fā)育特點及靶基因預測的結(jié)果，進一步篩選分析了一些miRNAs的靶基因及其在家蠶發(fā)育中的可能機制，這些都為我們?nèi)娴陌l(fā)掘和闡述miRNAs對家蠶發(fā)育的調(diào)控作用提供了理論依據(jù)。

5 展 望

隨著新一代高通量測序的成熟和普及，利用這項技術(shù)鑒定和篩選綿羊組織和細胞中的miRNA的研究報道越來越多，取得了不少成果。在綿羊基因組信息還不完整背景下，關于與目標性狀密切相關的具體miRNA的靶基因及其調(diào)控機制還不清楚，研究也非常欠缺。當然這一點既是重點，也是難點。因為只有我們把具體的miRNA的靶基因找到，才能闡明miRNA調(diào)控性狀的分子機制。

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Progress ofm iRNA Research in Animal Embryonic Development

WUWei-wei，Gong Ping，HANIKEZI，SHIXiao-lei，YU Li-juan，
XU Xin-ming，TIAN Yue-zhen，TIAN Ke-chuan*
(Institute of Animal Sciences,Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi830000，China)

MicroRNAs(miRNAs)are non-coding RNA in eukaryotes,With functions of regulating,which is made up by 20-25 bases,and they regulate target gene expression at transcriptional and posttranscriptional levels by specific base-pairing with targetmRNA,So as to accomplish the target gene transcription regulation. This article reviewed the found ofmicroRNAs,the mechanism of generation and action in vivo,the research and identification ofmiRNA in animal embryonic development,and the problems and prospect in the study were elaborated.

miRNA;animal;embryonic development

S814.8

A

1003－6377（2014）01－0001-09

2013-11-20

自治區(qū)公益性院所基金項目；國家農(nóng)業(yè)杰出人才及創(chuàng)新團隊建設項目；國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-02）

吳偉偉（1981－），女，吉林人，博士，助理研究員，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。

田可川（1963-），男，研究員，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。