哨兵動物口蹄疫抗體及病原學(xué)檢測報(bào)告

郭會玲,易 忠,魏玉榮，馬文戈，埃尼瓦爾·太外庫力，斯馬依·伊斯拉木，

達(dá)力夏·孜乃提5，包拉提6，魏 婕2，王 延2，薛 英2，黃 炯2*，姚 剛1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆喀什地區(qū)動物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；4.新疆塔什庫爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；5.新疆塔什庫爾干縣達(dá)布達(dá)爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

哨兵動物口蹄疫抗體及病原學(xué)檢測報(bào)告

郭會玲1、2,易 忠2,魏玉榮2，馬文戈2，埃尼瓦爾·太外庫力3，斯馬依·伊斯拉木4，

達(dá)力夏·孜乃提5，包拉提6，魏 婕2，王 延2，薛 英2，黃 炯2*，姚 剛1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆喀什地區(qū)動物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；4.新疆塔什庫爾干縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；5.新疆塔什庫爾干縣達(dá)布達(dá)爾鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 塔什庫爾干 845250；6.新疆昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835600）

2013年哨兵動物口蹄疫抗體及病原學(xué)檢測結(jié)果表明，哨兵動物群體中不存在口蹄疫病畜或健康帶毒畜，但是群體口蹄疫免疫抗體水平不高，需要強(qiáng)化免疫。

哨兵動物；口蹄疫；免疫抗體；病原學(xué)

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是有口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的世界性重大動物疫病，嚴(yán)重制約著全球畜牧業(yè)的發(fā)展，世界各國深受其害[1]。為了了解新疆邊境地區(qū)野生偶蹄動物中口蹄疫潛伏和感染狀況，評價(jià)和監(jiān)測口蹄疫隨野生動物跨境傳播的流行因素，本研究團(tuán)隊(duì)在邊境地區(qū)設(shè)置哨兵動物監(jiān)測站，并對哨兵動物進(jìn)行口蹄疫抗體水平及病原學(xué)檢測?，F(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集情況動物種類：羊、牛、牦牛及駱駝。樣品種類：血清、O-P液。

采集地點(diǎn)：阿爾泰山山區(qū)哨兵動物監(jiān)測站、天山山區(qū)哨兵動物監(jiān)測站及昆侖山山區(qū)哨兵動物監(jiān)測站。

1.2 檢測方法及試劑盒

口蹄疫免疫抗體檢測使用液相阻斷ELISA（Liquid-phase blocking ELISA）方法，試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號20130927。

口蹄疫感染抗體檢測使用非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC ELISA（FMD 3ABC-I-ELISA）方法，試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號20130710。

口蹄疫病原學(xué)檢測采用多重RT-PCR（Multi-RT-PCR）方法，試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號20130827。

1.3 操作步驟與判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 口蹄疫免疫抗體檢測

按照口蹄疫免疫抗體檢測使用液相阻斷ELISA（Liquid-phase blocking ELISA）說明書的要求進(jìn)行。結(jié)果判定：

1.3.1.1 試驗(yàn)成立的標(biāo)準(zhǔn) 每次試驗(yàn)，每塊板必須設(shè)立病毒抗原對照和陰陽性血清對照。病毒抗原對照至少兩個(gè)孔的OD值在1.0以上，最好在1.0～1.6之間；陽性對照抗體滴度應(yīng)在1∶10241滴度；陰性對照抗體滴度應(yīng)小于1∶4。

1.3.1.2 病毒抗原對照平均OD值50%計(jì)算（臨界值） 抗原對照孔是4孔，分別棄去最高和最低OD值，計(jì)算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即為50%對照值。該值即為臨界值。

1.3.1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 以病毒抗原對照平均OD值的50%為臨界值。被檢血清OD值大于臨界值的孔為陰性，小于或等于的孔為陽性，陽性孔的OD值等于臨界值時(shí)所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。如病毒抗原對照平均OD值為1.2，則其50%為0.6。如待檢血清在1∶128時(shí)的OD值為0.6，則該份待檢血清的抗體滴度為1∶128。若臨界值處于兩個(gè)之間，則抗體滴度取中間值。

1.3.1.4 ELISA抗體滴度與免疫動物攻毒保護(hù)的關(guān)系 牛、羊：ELISA抗體效價(jià)≥1∶128時(shí)，屬于99%以上保護(hù)范圍；ELISA抗體效價(jià)≤1∶16時(shí)，屬于不保護(hù)范圍，需要進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；抗體效價(jià)在1∶22～1∶90時(shí)，屬于50%保護(hù)效價(jià)范圍，需要進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.3.2 口蹄疫感染抗體檢測

按照口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒（FMD 3ABC-I-ELISA）說明書的要求進(jìn)行。

結(jié)果判定：按檢測試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)，即效價(jià)＜0.2，為陰性；效價(jià)在0.2～0.3之間為可疑；效價(jià)＞0.3為陽性。陽性樣品應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢。

1.3.3 口蹄疫病原學(xué)檢測

按照口蹄疫病原學(xué)檢測采用多重RT-PCR（Multi-RT-PCR）說明書的要求進(jìn)行。

結(jié)果判定紫外燈下，強(qiáng)陽性樣品電泳結(jié)果應(yīng)為3條大小不一的條帶，分別為634bp、483bp和278bp。某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物DNA帶至少有一條與上述條帶大小相符，同時(shí)空白對照無擴(kuò)增條帶，則該樣品判定為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 哨兵動物監(jiān)測站樣品采集情況

本研究邊境地區(qū)哨兵動物監(jiān)測站動物進(jìn)行定期采樣，采樣涉及3個(gè)地區(qū)4種動物2種類型的樣品，共計(jì)566份樣品，具體樣品采集情況見表1。

表1 動物樣品采集情況

2.2 哨兵動物監(jiān)測站動物樣品口蹄疫檢測情況

為了清楚的了解哨兵動物口蹄疫免疫情況及攜帶或感染口蹄疫情況，分別對采集的動物樣品進(jìn)行了口蹄疫3種檢測項(xiàng)目，具體見表2。

表2 監(jiān)測站動物樣品口蹄疫檢測情況

2.3 口蹄疫免疫抗體檢測結(jié)果

采集哨兵動物樣品的口蹄疫3種血清型免疫抗體檢測結(jié)果見表3。

表3 哨兵動物口蹄疫免疫抗體檢測結(jié)果

從表3中可見，阿爾泰山的駱駝口蹄疫免疫抗體最低，3種血清型抗體均≤1:16；阿爾泰山的牛及天山的牛口蹄疫免疫抗體水平比較整齊，3種血清型抗體幾乎均在22～90或≥1:128；3個(gè)地區(qū)的羊及昆侖山的牦?？谔阋呙庖咚骄桓?，有待于免疫加強(qiáng)。

2.4 口蹄疫感染抗體檢測結(jié)果

采集哨兵動物樣品的口蹄疫感染抗體檢測結(jié)果如表4。

表4 哨兵動物樣品口蹄疫感染抗體監(jiān)測結(jié)果

從表4中可見牦牛未檢測到感染抗體；阿爾泰山的牛、羊中也未檢測到口蹄疫感染抗體；昆侖山的牛、羊口蹄疫感染陽性率分別是6.35%和7.98%；天山的牛、羊感染抗體陽性率更高，分別是89.47%和16.13%?？谔阋吒腥究贵w水平高，可能來自兩個(gè)方面：曾經(jīng)感染過口蹄疫；反復(fù)注射疫苗后引起的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體致使檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陽性。為了更清楚獲知感染抗體陽性動物是真正被口蹄疫感染還是注射疫苗造成，可通過病原學(xué)檢測佐證。

2.5 口蹄疫病原學(xué)樣品監(jiān)測結(jié)果

采集哨兵動物樣品的口蹄疫病原學(xué)檢測結(jié)果如表5，部分樣品的RT-PCR結(jié)果見圖1。

表5 哨兵動物樣品口蹄疫病原學(xué)檢測結(jié)果

圖1 部分哨兵動物樣品口蹄疫病原學(xué)檢測RT-PCR結(jié)果

從表5和圖1（部分樣品RT-PCR電泳結(jié)果）可見，3個(gè)地區(qū)186份樣品的病原學(xué)檢測均為陰性，可見上述哨兵動物均不存在口蹄疫感染情況，檢測到的高感染抗體水平均有反復(fù)注射疫苗引起，也間接反應(yīng)3ABC-I-ELISA試劑盒在檢測反復(fù)疫苗動物感染抗體水平時(shí)存在不足，如果要確實(shí)掌握動物群體口蹄疫感染情況，必須將免疫抗體檢測與病原學(xué)檢測相結(jié)合。

3 討 論

哨兵動物(sentinel animals)通常為有意識地暴露在某一特定環(huán)境中用來查明某傳染因子存在狀況的易感動物。由于哨兵動物在動物疫病監(jiān)測中具有成本低、使用方便及可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，OIE和發(fā)達(dá)國家所普遍采用哨兵動物進(jìn)行動物疫病監(jiān)測[2]。

本研究中通過對阿爾泰山、天山及昆侖山邊境地區(qū)哨兵動物監(jiān)測站動物進(jìn)行樣品采集、樣品口蹄疫抗體及病原學(xué)檢測，結(jié)果顯示目前哨兵動物群體中不存在口蹄疫病畜或健康帶毒畜。

3個(gè)地區(qū)的哨兵動物群體口蹄疫免疫抗體較低，且免疫抗體參差不齊，尤其是阿爾泰山山區(qū)的駱駝幾乎檢測不到免疫抗體水平（3種血清型抗體均≤1:16），因此3個(gè)地區(qū)的哨兵動物群體均需要加強(qiáng)口蹄疫免疫。

雖然哨兵動物樣品感染抗體檢測中出現(xiàn)極高的感染抗體水平即天山山區(qū)的牛、羊感染抗體陽性率分別是89.47%和16.13%，但是通過病原學(xué)復(fù)核檢測后發(fā)現(xiàn)病原學(xué)樣品監(jiān)測結(jié)果均為陰性。這些與本研究團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)的檢測結(jié)果一致：感染抗體水平高與動物免疫次數(shù)有一定關(guān)系，免疫的次數(shù)越多，其檢出率越高[3]。

[1]王永錄，張永光，方玉珍，等.我國不同時(shí)期A型口蹄疫流行概況及疫苗毒株與流行毒株抗原關(guān)系[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013,43（S1）:7-10.

[2]藺長明.巴西應(yīng)用哨兵動物監(jiān)測口蹄疫[J].畜牧與獸醫(yī),2003,35(2):27.

[3]易忠，郭會玲，康強(qiáng)，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測和多重RT-PCR試劑盒的檢測結(jié)果對比[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013,43（S1）:297-299.

Survey Report on the Antibody and the Etiology of Foot-and-M outh Disease of Sentinel Animal

GUO Hui-ling1、2,YIZhong2,WEIYu-rong2,MAWen-ge2,AINIWAER·Taiwaikuli3, SIMAYI·Yisilamu4,DALIXIA·Zimaiti5,BAO La-ti6,WEIJie2,WANG Yan2, XUE Yin2,HUANG Jiong2*,YAO Gang1
1.Veterinary Department，Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,China; 2.Institute of Veterinary Science,Animal Sciences Academy of Xinjiang,Urumqi830000,China; 3.Control and Diagnosis Center of the Animal Disease from Kashgar Region,Kashgar 844000,China;
4.Stock Farm Veterinary Station of Tashkurgan County，Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 5.Dabudar Country Stock Farm Veterinary Station of Tashkurgan County, Tashkurgan Xinjiang 845250，China; 6.Stock Farm Veterinary Station of Zhaosu County,Zhaosu Xinjiang 835600,China.

The present Survey was done on the antibody and the etiology of foot-and-mouth disease of sentinel animal in 2013.The results showed that there were not exist foot-and-mouth disease in the sentinel animals.Nevertheless immune antibodies of foot-and-mouth disease were lower level in the sentinel animals, need to strengthen the immune.

sentinel animals；foot-and-mouth disease；immune antibodies；etiology

S855.5

A

1003－6377（2014）01－0064-05

2013-12-22

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2013BAD2B04），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103008）

郭會玲（1973-），女，甘肅人，獸醫(yī)師，研究生，主要從事動物傳染病研究。

黃炯（1963-），男，新疆人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病與生物制品研發(fā)。