西藏青稞酒曲中真菌的分離與鑒定

郭小芳 王燕鴿 劉 帥 羅開(kāi)放 張 柯

(西藏大學(xué)理學(xué)院 西藏拉薩 850000)

西藏青稞酒曲中真菌的分離與鑒定

郭小芳 王燕鴿 劉 帥 羅開(kāi)放 張 柯

(西藏大學(xué)理學(xué)院 西藏拉薩 850000)

酒曲微生物對(duì)酒的產(chǎn)出率和品質(zhì)有極大影響。研究西藏青稞酒酒曲中微生物的多樣性對(duì)于高品質(zhì)青稞酒的開(kāi)發(fā)具有重要意義。取自西藏6個(gè)地區(qū)的9份民間青稞酒酒曲中分離、純化得到67株霉菌；觀察固體培養(yǎng)特征和顯微特征，將這些菌株分為4個(gè)屬，7個(gè)種，分別為總狀毛霉(Mucor racemosus)、魯氏毛霉(Mucor rouxii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、?，F(xiàn)青霉(Penicillium frequentans)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)及粗糙脈胞菌(Neurospora crassa)。

西藏青稞酒；酒曲；真菌；鑒定；分離

我國(guó)用曲釀酒已有幾千年的歷史，酒曲是中國(guó)酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑,含有多種微生物及其產(chǎn)生的酶,其質(zhì)量對(duì)酒的產(chǎn)出率和品質(zhì)有極大的影響。其中，酒曲微生物是制酒原動(dòng)力，酒曲的質(zhì)量離不開(kāi)其微生物菌群功能的發(fā)揮。因此，研究酒曲微生物的性能對(duì)揭示我國(guó)酒的釀造規(guī)律有著十分重要的意義。

隨著科學(xué)技術(shù)與釀酒工業(yè)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代以后，我國(guó)酒曲微生物的研究迅速興起,并極大地推動(dòng)了制曲釀酒的迅猛發(fā)展。羅文等[1]從4種酒曲中分離得到7株糖化菌和4株酵母菌。張東亮等[2]篩選出具有較高糖化和酯化能力的曲霉菌。于博等[3]對(duì)廣東肇慶傳統(tǒng)小曲的優(yōu)勢(shì)霉菌進(jìn)行了分離,得到糖化酶活力強(qiáng)的一株米根霉。喻鳳香等[4]從酒曲中分離到30株根霉菌。馬蕤等[5]從湖北民間傳統(tǒng)酒曲中分離到1株產(chǎn)糖化酶活力強(qiáng)的米根霉。王世強(qiáng)等[6]對(duì)蘇州酒曲與徽州酒曲中的酵母菌和霉菌菌落及個(gè)體形態(tài)、生長(zhǎng)狀況、淀粉酶活力及酒化力等方面進(jìn)行了比較。Wang等[7]對(duì)茅臺(tái)酒曲中200多個(gè)菌落進(jìn)行定性分析,顯示存在細(xì)菌、霉菌和酵母菌，其中霉菌由曲霉屬、白霉屬、根霉屬、紅曲霉和木霉屬組成。劉洪偉等[8]從貴州茅臺(tái)酒酒曲分離出5株真菌，分別鑒定為米曲霉、紅色紅曲菌、黑曲霉、炭黑曲霉和米根霉。李健容等[9]從選取的民間傳統(tǒng)酒曲中分離得到酵母菌和根霉菌，其中根霉菌分別為米根霉和華根霉。

青稞，又稱為裸大麥、元麥或裸麥，是藏區(qū)主要農(nóng)作物，主要用于生產(chǎn)糌粑和青稞酒。青稞酒是一種釀制歷史悠久、極富民族特色的低度發(fā)酵酒，該酒酒味酸甜，酒香濃郁，是藏族人民日常生活不可或缺的飲品之一。由于地域等限制，對(duì)于青稞酒曲微生物的研究并不如內(nèi)地工業(yè)生產(chǎn)酒曲及傳統(tǒng)酒曲那般興盛，僅有一些零星報(bào)道。杜木英等[10，11]研究了傳統(tǒng)青稞酒發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并比較了青稞酒多菌種曲發(fā)酵與傳統(tǒng)曲發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律等。青稞酒在西藏釀制十分廣泛，各地區(qū)由于交通、環(huán)境條件等差異導(dǎo)致青稞酒曲中微生物種類和數(shù)量存在差異，因此本實(shí)驗(yàn)在以往工作的基礎(chǔ)上[12]以源自西藏六個(gè)地區(qū)的青稞酒酒曲為研究對(duì)象，分離并鑒定了青稞酒酒曲中主要霉菌，并比較了九份樣品中霉菌的種類和數(shù)量，期望為西藏傳統(tǒng)青稞酒真菌物種多樣性提供理論依據(jù)，并為青稞酒發(fā)酵菌種配方的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 酒曲

九份酒曲分別采自拉薩市曲水縣、那曲地區(qū)索縣、山南地區(qū)曲松縣、林芝地區(qū)察隅縣、林芝地區(qū)林芝縣、昌都地區(qū)昌都縣、昌都地區(qū)江達(dá)縣、日喀則地區(qū)謝通門縣、日喀則地區(qū)仁布縣。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和改良馬丁氏培養(yǎng)基。

2 研究?jī)?nèi)容與方法

2.1 酒曲中真菌的分離與純化

分離：取9份樣品各1.0g，用研缽研成粉末，分別均勻撒在馬鈴薯葡萄糖、察氏及改良馬丁氏培養(yǎng)基上，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，置于25℃下培養(yǎng)5～7d。

純化：用平板劃線法進(jìn)行酒曲中真菌的純化，培養(yǎng)基采用改良馬丁氏培養(yǎng)基。

2.2 酒曲中霉菌的鑒定

菌落形態(tài)觀察和記錄：選取無(wú)污染、生長(zhǎng)良好的純化菌株的平板，觀察并記錄菌落形態(tài)（菌落表面、菌落正反面顏色、中心及邊緣顏色等）。

顯微特征觀察：在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢（放大倍數(shù)一般為640倍）。

鑒定：結(jié)合真菌的固體培養(yǎng)特征及顯微觀察特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》、《常見(jiàn)和常用真菌》，初步鑒定真菌的種類。

3 結(jié)果分析

3.1 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中真菌固體培養(yǎng)特征

從西藏九份青稞酒曲中共分離到67個(gè)真菌菌株。從表1可以看出，分離到的真菌在改良馬丁氏培養(yǎng)基上的菌落特征基本包括九類；Lhqp、Lhqm2、Nsp1、Sqp1、Sqc2、Lcp、Lcc2、Llp、Llc1、Ccp、Ccc1、Cp1、Cc1、Cm2、Rxc3、Rc1等16個(gè)菌株菌落特征相同；Lhqc1、Sqc1、Llc2、Ccc2、Rxc1等5個(gè)菌株菌落特征相同；Lhqc2、Lhqm4、Nsp2、Nsc3、Sqp2、Sqc4、Sqm2、Llc3、Llm2、Ccc5、Cp2、Cc3、Cm3、Rxp2、Rxc4、Rc3、Rm3等

17個(gè)菌株菌落特征相同；Lhqc3、Nsp3等2個(gè)菌株菌落特征相同；Lhqm1、Nsc1、Nsm、Sqc3、Sqm1、Lcc1、Lcm、Llm1、Ccc4、Cm1、Rxc2、Rc2等12個(gè)菌株菌落特征相同；Lhqm3、Ccm、Cc2、Rxm、Rm1等5個(gè)菌株菌落特征相同；Nsc2、Lcc3、Ccc3、Rxp1、Rp1、Rm2等6個(gè)菌株菌落特征相同；Sqm3、Lcc4、Cc4等3個(gè)菌株菌落特征相同。

表1 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲真菌固體培養(yǎng)特征

表2 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲真菌顯微特征

3.2 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中真菌顯微特征（見(jiàn)表2）

為鑒定青稞酒曲中分離的真菌，對(duì)分離到的菌株逐一進(jìn)行了顯微觀察。如表2所示，酒曲樣品中真菌的顯微特征大體上可分為七類；Lhqp、Lhqm2、Nsp1、Sqp1、Sqc2、Lcp、Lcc2、Llp、Llc1、Ccp、Ccc1、Cp1、Cc1、Cm2、Rxc3、Rc1等16個(gè)菌株顯微特征相同；Lhqc1、Lhqm3、Nsc2、Sqc1、Lcc3、Llc2、Ccc2、Ccc3、Ccm、Cc2、Rxp1、Rxc1、Rxm、Rp1、Rm1、Rm2等16個(gè)菌株的顯微特征相同；Lhqc2、Lhqm5、Nsp2、Nsc3、Sqp2、Sqc4、Sqm2、Llc3、Llm2、Ccc5、Cp2、Cc3、Cm3、Rxp2、Rxc4、Rc3、Rm3等17個(gè)菌株顯微特征相同；Lhqc3、Nsp3顯微特征相同；Lhqm1、Nsc1、Nsm、Sqc3、Sqm1、Lcc1、Lcm、Llm1、Ccc4、Cm1、Rxc2、Rc2等12個(gè)菌株顯微特征相同；Sqm3、Lcc4、Cc4等3個(gè)菌株顯微特征相同。

3.3 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中霉菌的鑒定結(jié)果（見(jiàn)表3）

通過(guò)分析并比較真菌的菌落特征與顯微特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》以及《常見(jiàn)和常用真菌》等資料書，對(duì)青稞酒酒曲真菌進(jìn)行了鑒定，初步鑒定結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，西藏不同地區(qū)酒曲中共分離得到七種真菌，包括：總狀毛霉、魯氏毛霉、爪哇毛霉、?，F(xiàn)青霉、產(chǎn)黃青霉、粗糙脈胞菌以及米根霉。

表3 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中真菌的鑒定結(jié)果

3.4 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中真菌種類及數(shù)量比較（見(jiàn)表4）

表4 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲中真菌種類及數(shù)量

表4顯示，總狀毛霉、魯氏毛霉及爪哇毛霉在各地區(qū)酒曲樣品中均能分離得到，各個(gè)地區(qū)這三種毛霉菌數(shù)量存在一定差異；?，F(xiàn)青霉除林芝地區(qū)察隅縣酒曲中未分離到外，其他八個(gè)地區(qū)酒曲中均能分離到，且山南地區(qū)曲松縣與昌都地區(qū)江達(dá)縣的酒曲中分離到常現(xiàn)青霉的數(shù)量略高于其他五個(gè)地區(qū)；產(chǎn)黃青霉僅在拉薩曲水縣與那曲索縣酒曲中分離得到，且數(shù)量比較少；粗糙脈孢菌僅在山南曲松縣、林芝地區(qū)察隅縣及昌都地區(qū)江達(dá)縣酒曲中分離得到，數(shù)量相對(duì)較少；米根霉僅在日喀則仁布縣酒曲中分離得到。

比較幾個(gè)地區(qū)青稞酒曲真菌種類，可以看出，九份樣品中真菌種類多少差別不大，基本有四種或五種。

4 討論

從西藏青稞酒酒曲中分離到的霉菌主要包括米根霉、總狀毛霉、魯氏毛霉以及爪哇毛霉，這些與內(nèi)地酒曲中分離到的霉菌種類相一致。本研究還分離到兩株青霉菌，青霉菌不屬于酒曲中主要的糖化菌，但是有學(xué)者報(bào)道在酒曲中有青霉菌的存在。如，馬青山等[13]通過(guò)對(duì)云南瀾滄江集團(tuán)中溫大曲曲衣和曲心中微生物進(jìn)行分離與初步鑒定，發(fā)現(xiàn)大曲中霉菌以青霉屬和毛霉目為主；姚萬(wàn)春等[14]系統(tǒng)地研究了瀘州老窖國(guó)窖曲不同層次間微生物數(shù)量、種類和優(yōu)勢(shì)種群差異及規(guī)律，發(fā)現(xiàn)，國(guó)窖曲曲外層以霉菌、酵母菌為主，其中霉菌中含有青霉菌。在個(gè)別樣品中還分離出了粗糙脈孢菌，此菌未在酒曲微生物相關(guān)報(bào)道中提及。

目前，人們對(duì)酒曲微生物的研究主要在集中分離、純化、鑒定和保藏，酒曲微生物主要菌群的交替演繹規(guī)律的研究以及理化分析及優(yōu)質(zhì)功能菌的選育和應(yīng)用等方面。從研究手段上來(lái)看，基本上還處于傳統(tǒng)微生物研究階段，借助于分子生物手段等先進(jìn)方法的相對(duì)較少，青稞酒的研究也是如此。今后應(yīng)著力采用分子生物學(xué)與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合的手段，以便全面了解西藏青稞酒酒曲生物多樣性。

[1]羅文,張永華,王啟軍.生料釀酒用微生物的分離與篩選[J].中國(guó)釀造,2006(3):20-23.

[2]張東亮,王啟軍,林萍,等.生料釀酒用高糖化及酯化能力紅曲霉菌株的選擇[J].食品工業(yè)科技,2007,28(10):111-112.

[3]于博,董開(kāi)發(fā),張鳳英.廣東肇慶傳統(tǒng)酒曲優(yōu)勢(shì)霉菌的分離及鑒定[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2007,7(1):95-99.

[4]喻鳳香,陳煦,林親錄,等.酒曲根霉的分離純化及淀粉酶活力測(cè)定[J].釀酒,2006,33(3):39-41.

[5]馬蕤,朱江,張鳳英,等.湖北傳統(tǒng)酒曲中優(yōu)勢(shì)霉菌F14的鑒定[J].釀酒科技,2007(9):17-19.

[6]王世強(qiáng)，鄭揚(yáng)云.2種地方酒曲主要微生物特性的比較研究[J].中國(guó)釀造,2010(3):141-142.

[7]Wang CL,Shi DJ,Gong GL.Microorganisms in Daqu:a starter culture of Chinese Maotai-flavor liquor[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,24(10):2183-2190.

[8]劉洪偉,鄔應(yīng)龍.茅臺(tái)酒酒曲中5株真菌的分離、純化、鑒定初報(bào)[J].發(fā)酵科技通訊,2011(4):26-27.

[9]李健容,蔡愛(ài)群.民間傳統(tǒng)酒曲主要微生物的分離及鑒定[J].釀酒科技,2007(5):111-121.

[10]杜木英,伍怡酈,闞建全,等.傳統(tǒng)青稞酒發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分動(dòng)態(tài)變化的研究[J].食品工業(yè)科技,2007(9):94-97.

[11]曹妍,杜木英,闞建全,等.多菌種發(fā)酵青稞酒化學(xué)成分變化研究[J].食品科學(xué),2012(11):252-256.

[12]德吉,郭小芳,曲吉,等.酒曲微生物成分對(duì)青稞酒品質(zhì)的影響研究[J].西藏科技,2008(6):23-25.

[13]張青山，馬淼，吳永安,等.云南瀾滄江中溫大曲中微生物初步分析[J].中國(guó)釀造,2010（3）：84-85.

[14]姚萬(wàn)春，唐玉明，任道群，等.瀘州老窖國(guó)窖曲曲坯層次間微生物差異研究［J］.釀酒，2005，32（5）：35-36.

Isolation and Identification of Fungus from the Tibetan Highland Barley Wine Yeast

Guo Xiao-fang Wang Yan-ge Liu-Shuai Luo Kai-fang Zhang-Ke
(School of Science,Tibet University,Lhasa 850000,Tibet)

Microbes in distiller's yeast have a great effect on the yield and quality of liquor.Research on the microbial diversity in the Tibetan highland barley wine yeast is great important for development of high-quality barley wine.67 strains of fungus were isolated from nine samples of highland barely wine yeasts collected from six regions in Tibet.Based on the cultured and microscopic characteristics,these strains can be identified 7 species such as Mucor racemosus,Mucor rouxii,Mucor javanicus,Rhizopus oryzae,Penicillium frequentans,Penicillium griseofulvum and Neurospora crassa.

Tibetan highland barely wine;Wine Yeast;fungus;identification;isolation

S512.3

A

1005-5738(2014)02-037-07

[責(zé)任編輯：蔡秀清]

2014-06-11

2013年度西藏自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“西藏青稞酒曲微生物多樣性及發(fā)酵菌種配方優(yōu)化研究”階段性成果，項(xiàng)目號(hào)：2013CX013

郭小芳，女，漢族，甘肅蘭州人，西藏大學(xué)理學(xué)院副教授，主要研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)及植物生態(tài)學(xué)。