H PLC指紋圖譜法測定不同粉碎度野山花旗參粉末中人參皂苷含量

卓丹如 錢麗萍 章寧 林綏 闕慧卿 林善財

（1福州瑞來春堂生物科技有限公司，福建福州350007；2福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物所，350001）

H PLC指紋圖譜法測定不同粉碎度野山花旗參粉末中人參皂苷含量

卓丹如1錢麗萍2章寧1林綏2闕慧卿2林善財1

（1福州瑞來春堂生物科技有限公司，福建福州350007；2福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物所，350001）

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜法，測定野山花旗參100目、200目、1 000目粉三種粉末中人參皂苷Re、Rb1、Rg1的總含量，通過指紋圖譜相似度比較，考察粉碎對野山花旗參中人參皂苷的影響。方法：采用梯度洗脫、HPLC測定三種粒徑粉末的HPLC指紋圖譜，計算主要藥效成分人參皂苷Re、Rb1、Rg1的含量，并進(jìn)行比較，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”評價三個樣品的相似度。結(jié)果：野山花旗參100目、200目、1 000目粉的主要有效成分人參皂苷Re、Rb1、Rg1的總含量均大于3.96%，三種粉末的指紋圖譜重疊率高，共有峰的相對保留時間吻合，與生成的對照指紋圖譜相似度分別為0.946，0.979，0.970。結(jié)論：野山花旗參100目、200目與1 000目粉的HPLC指紋圖譜相似度大于0.946，化學(xué)成分的種類沒有變化，主要有效成分人參皂苷Re、Rb1、Rg1的總含量基本相等，野山花旗參超微粉碎成1 000目粉，化學(xué)成分保持不變。

野山花旗參粉末；粉碎度；人參皂苷；HPLC指紋圖譜；相似度

花旗參為五加科人參屬植物西洋參的俗名，主產(chǎn)在美國和加拿大，藥用部分為干燥的根[1]。具有抗疲勞、抗缺氧、抗癌、抗衰老等作用，可增強機體耐缺氧能力，保護心臟；具有增強學(xué)習(xí)與記憶的功能，還具有防治動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂代謝等藥理作用[2]。野山花旗參屬于貴重的滋補良品，常采用粉末口服給藥，粉末的粒徑與其有效成分的溶出度和溶出速率有直接的關(guān)系，因此采用適宜的加工工藝，保存有效成分，提高生物利用度具有積極的意義。楊連威等[3]認(rèn)為中藥超微粉碎后可提高藥物中有效組分的溶出率，增大藥物的生物利用度，有利于保存生物活性成分，節(jié)省藥材，降低藥物用量等優(yōu)點。前期實驗采用超純水為溶出介質(zhì)，考察同批號的3種野山花旗參粉（100目、200目、1 000目粉），發(fā)現(xiàn)野山花旗參超微粉（1 000目粉）的人參皂苷Rb1溶出迅速，溶出曲線平穩(wěn)，超微粉碎有利于人參皂苷Rb1的溶出[4]。

色譜指紋圖譜相似度用于中藥質(zhì)量穩(wěn)定性的評價，簡單易行，易于推廣，是中藥質(zhì)量控制的重要手段。色譜指紋圖譜相似度可用于中藥材的品種鑒別及中藥生產(chǎn)中原料、中間體和產(chǎn)品的質(zhì)量控制，不同的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)應(yīng)選擇合適的相似度方法以及針對不同的中藥對象選用合適的相似度方法是中藥質(zhì)量評價中的一個關(guān)鍵問題[5]。本實驗應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）測定野山花旗參100目、200目和1 000目粉的總皂苷含量，建立野山花旗參粉指紋圖譜分析方法，并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》評價3種粒徑粉末的化學(xué)成分種類及含量變化，考察超微粉碎后野山花旗參粉的物質(zhì)基礎(chǔ)變化情況，提高野山花旗參的生物利用度，為野山花旗參粉的質(zhì)量控制提供積極作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT島津高效液相色譜儀（日本），AL-204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），水浴鍋（上海申生科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Re對照品（購自原中國藥品生物制品檢定所，批號：110754-200822），人參皂苷Rb1對照品（購自原中國藥品生物制品檢定所，批號：110704-201122），人參皂苷Rg1對照品（購自原中國藥品生物制品檢定所，批號：110703-201027），野山花旗參100目粉（細(xì)粉），200目粉（極細(xì)粉），1 000目粉（超細(xì)粉）（由福州瑞來春堂生物科技有限公司提供，原產(chǎn)地：美國，批號Y03120901），正丁醇（西隴化工股份有限公司）、無水乙醇（西隴化工股份有限公司），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），超純水（自制）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件[1]

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填充劑；柱溫：室溫；流速：1.0 m L/m in；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：20 μL，流動相：A水，B乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動相比例

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re、Rb1、Rg1適量于量瓶中，加甲醇制成每1 m L各含人參皂苷Re 0.69 mg，人參皂苷Rb11.08 mg，人參皂苷Rg10.19 mg的溶液，備用。

2.3供試品溶液的制備

取各種粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 m L，稱定重量，置水浴中加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 m L，置蒸發(fā)皿中，蒸發(fā)，殘渣加50%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

將上述對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結(jié)果表明，供試品與對照品在相同的保留時間內(nèi)出現(xiàn)吸收峰，峰形較好，理論塔板數(shù)大于8 000，各雜質(zhì)峰無干擾，達(dá)到了較好的分離效果。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL，按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，求得人參皂苷Re、Rb1、Rg1的RSD分別為0.92%，1.05%，0.88%（n=5）。表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品溶液（野山花旗參100目粉1號提取液），在0，1，2，4，8，24 h取20 μL注入高效液相色譜儀，測定人參皂苷Re、Rb1、Rg1的峰面積，計算人參皂苷的總含量，結(jié)果其相對偏差RSD分別為1.32%，1.45%，1.08%，表明樣品放置24 h，人參皂苷Re、Rb1、Rg13種成分穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取同一個供試品（野山花旗參100目粉1號提取液），按上述條件平行提取并測定6次，結(jié)果人參皂苷Re、Rb1、Rg1的RSD分別為1.055%，1.38%，1.42%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 回收率實驗

精密量取已知含量的提取液（野山花旗參100目粉1號提取液）適量，精密加入相應(yīng)比例的人參皂苷Re、Rb1、Rg1對照品，提取并測定，計算回收率，人參皂苷Re、Rb1、Rg1的平均回收率分別為99.6%，101.05%，98.76%。RSD分別為1.57%，0.94%，1.09%（n=6）。

2.9 含量測定

精密吸取對照品溶液、供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，采用梯度洗脫法測定峰面積，計算各供試品人參皂苷Re、Rb1、Rg1的含量，色譜圖見圖1，含量結(jié)果如表1。并通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”比較四個樣品峰面積的細(xì)微差別，見圖2，計算相似度如表2。

圖1 野山花旗參不同粉碎度粉末HPLC圖

表2 三種不同粒徑樣品中人參皂苷Re、Rb1、Rg1平均值的總含量表

3 結(jié)果

通過對3種野山花旗參粉末中人參皂苷Re、Rb1、Rg1總量的測定，發(fā)現(xiàn)野山花旗參粉碎成200目與1 000目粉后，人參皂苷Re、Rb1、Rg1的總含量高于3.91%，均大于國家藥典規(guī)定的2.0%。

圖2 3種野山花旗參粉指紋圖譜對比

表2 3種野山花旗參粉相似度比較

從3種野山花旗參粉指紋圖譜中選取8個共有指紋峰，采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版）對野山花旗參100目、200目、1 000目粉的指紋圖譜進(jìn)行分析，生成對照圖譜和共有模式圖，3種粉末的8個共有峰相對保留時間吻合，相對峰面積波動不大，重疊率極高。以200目粉的指紋圖譜為對照，100目粉的相似度為0.87，1 000目粉的相似度為0.973；3種粉末與生成對照指紋圖譜的相似度分別為0.946，0.979，0.97，說明3種粉末相關(guān)性良好。通過與混合人參皂苷對照品色譜圖對比，指認(rèn)共有峰1、2、3分別為Re、Rb1、Rg1對照品色譜峰。表明野山花旗參粉碎成不同粒徑后，所含化學(xué)成分種類相似度較高，含量方面存在細(xì)微差異。

4 討論

西洋參具有滋補強壯、養(yǎng)血生精、寧神益智的功效，其主要藥效成分為人參總皂苷[6]，花旗參為五加科人參屬植物西洋參的俗稱，因主產(chǎn)于美國和加拿大而得名。本研究所用花旗參為美國產(chǎn)純天然野生品種，所受污染少，生長年限長，因此，其所含藥效成分如人參皂苷Re、Rb1、Rg1等通常遠(yuǎn)高于栽培品種，屬于貴重保健品，通過物理或化學(xué)方法保存野山花旗參的生物活性，增大溶出度，提高其生物利用度具有重要的意義。

前期實驗采用超純水為溶出介質(zhì)，考察同批號3種不同粒徑的野山花旗參粉，發(fā)現(xiàn)在溶出開始的前10 m in，極細(xì)粉（200目）的人參皂苷Rb1溶出率稍微大于細(xì)粉（100目），細(xì)粉又稍大于超微粉（1 000目），10 min以后，超微粉、極細(xì)粉和細(xì)粉的潤濕度慢慢接近，因為超微粉與溶出介質(zhì)的接觸面大于細(xì)粉和極細(xì)粉，所以溶出率迅速升高并達(dá)到平衡，而細(xì)粉和極細(xì)粉在90 m in內(nèi)溶出率呈緩慢上升趨勢。超微粉碎有利于野山花旗參人參皂苷Rb1的溶出[4]。本研究根據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定，梯度洗脫樣品，測定人參皂苷Re、Rb1、Rg1的總含量，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價3種粉末，發(fā)現(xiàn)同批號野山花旗參粉碎成不同粒徑后，主要有效成分人參皂苷Re、Rb1、Rg1總量基本保持不變，3種粉末指紋圖譜相似度大于0.946，推測3種粉末中化學(xué)成分相似，粉碎前后物質(zhì)基礎(chǔ)沒有改變。結(jié)合前期的研究[4]，得知超微粉碎可提高野山花旗參的生物利用度，提高資源利用率。

超微粉碎技術(shù)可提高人參皂苷Re、Rb1、Rg1的生物利用度，但野山花旗參作為貴重保健品，營養(yǎng)成分十分豐富，越細(xì)的粉末對存放條件的要求越高。因此，要保證超微粉碎技術(shù)在野山花旗參加工方面的絕對優(yōu)勢，藥材超微粉碎后應(yīng)迅速滅菌隔氧密封保存，以增加穩(wěn)定性，提高超微粉的質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：122-123.

[2]王筠默.西洋參藥理作用研究的最新進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2001，17（4）：46-48.

[3]楊連威，趙曉燕，李婷，等.中藥超微粉碎后對其性能的影響研究[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，10（6）：77-81.

[4]卓丹如，闕慧卿，章寧，等.不同粉碎度野生西洋參人參皂苷Rb1的體外溶出度研究[J].藥物評價研究，2013，36（5）：374-376.

[5]詹雪艷，林兆洲，段天璇，等.色譜指紋圖譜相似度方法的適應(yīng)性研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（5）：61-64.

[6]王蕾，王英平，許世全，等.西洋參化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究，2007，29（3）：73-77.

Content Determ ination of Ginseng Saponins of wild American Ginseng Powder in Different Crushing Degree by HPLC Fingerprint

Zhuo Danru1，Qian Liping2，Zhan Ning1，Lin Sui2，Que Huiqing2，Lin Shancai1（1 Fuzhou Ruilaichuntang Biological Technology Co.，Ltd.，F(xiàn)ujian Fuzhou 350007，China；2 Instituteof Medical Sciencesof Fujian Province，350001）

Objective:To establish a HPLC fingerprintmethod for the determ ination of the total content of Re，Rb1and Rg1in ginseng saponins of the wild American ginseng powder（100，200 and 1 000 mesh powder).To investigate the crushing effect on ginseng saponins of wild American ginseng by comparing the sim ilarity of HPLC fingerprints.M ethods: Using HPLC and gradient elution，the fingerprints of three kinds of particle size of powders were determ ined，and the contents of themain effective components of Re，Rb1，Rg1in ginseng saponin were calculated and compared.Through the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM，the similarity of the three samples was evaluated.Results:As themain active ingredientsof wild American ginseng，the contentsof Re，Rb1，Rg1of ginseng saponinwere all greater than 3.96%in the powder of 100，200 and 1 000 mesh，the fingerprint overlap rate of three kinds of powders was high，the relative retention time of the common peak was matched，and the generated fingerprint sim ilarity to the control was0.946，0.979 and 0.970 respectively.Conclusion：The HPLC fingerprintsimilarity of wild American ginseng（100，200 and 1 000 mesh powder）was greater than 0.946，the chemical composition of the species was not changed，the contents of Re，Rb1，Rg1of ginseng saponin as the main active ingredients were generally the same，and when wild American ginsengwasgrinded into 1 000mesh powder，the chemical components remained the same.

Wild American Ginseng Powder;Crushing Degree；Ginseng Saponins；HPLC Fingerprint；Similarity

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.08.005

2014-06-16）

卓丹如，女，藥師。研究方向：中藥生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量管理。E-mail：532056077@qq.com

闕慧卿，女，助理研究員。研究方向：中藥與天然藥物化學(xué)。通訊作者E-mail：284978108@qq.com