UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S測(cè)定緩解體力疲勞類保健品中非法添加的化學(xué)物質(zhì)

張圓 郝剛 閔春艷 吳楊 袁燦陽(yáng) 顧炳仁

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104；2江陰市利港醫(yī)院，江陰 214444）

UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S測(cè)定緩解體力疲勞類保健品中非法添加的化學(xué)物質(zhì)

張圓1郝剛1閔春艷1吳楊1袁燦陽(yáng)2顧炳仁1

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104；2江陰市利港醫(yī)院，江陰 214444）

目的：利用超高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測(cè)定緩解體力疲勞類保健食品中違法添加西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、偽伐地那非、硫代艾地那非、那紅地那非和育亨賓等12種化學(xué)藥品的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，以Agilent ZORBAX Eclipse plus C18為色譜柱；以0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸銨水溶液和甲醇梯度洗脫，流速為0.3 m L/min；ESI正離子模式，一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，進(jìn)行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。結(jié)果：經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法在2～80 μg/m L濃度范圍內(nèi)線性良好、精密度（RSD%）小于2%、回收率在80.5%～98.7%之間。結(jié)論：本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、分離度高，為快速篩查緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)提供有力工具。

超高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀；緩解體力疲勞；非法添加的化學(xué)物質(zhì)

治療男性性功能障礙的各種選擇性磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑類藥物層出不窮，該類藥物對(duì)并發(fā)心血管系統(tǒng)疾病和糖尿病患者有嚴(yán)重不良反應(yīng)，故須在醫(yī)生指導(dǎo)下使用。由于補(bǔ)腎壯陽(yáng)類藥物的高額利潤(rùn)，加之其合成路線早已不是秘密，因此，一些不法分子為牟取暴利，非法添加此類化學(xué)成分進(jìn)入保健食品，宣稱具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)功效[1]。西地那非已成為中國(guó)保健品市場(chǎng)最常見(jiàn)的非法添加藥物[2]。緩解體力疲勞類保健品中非法添加PDE-5抑制劑會(huì)蒙蔽該類藥物有針對(duì)性的使用群體和適宜劑量，以“短暫的好轉(zhuǎn)”帶來(lái)“巨大的副作用”。本研究旨在為打擊非法添加化學(xué)物質(zhì)開(kāi)發(fā)專屬性強(qiáng)，靈敏度高的快篩快檢的方法。

目前，國(guó)內(nèi)外致力于采用多種方法打擊緩解體力疲勞類保健食品中非法添加的PDE-5抑制劑的行為。高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS），液相色譜（LC）-質(zhì)譜（MS），核磁共振掃描（NMR），離子遷移譜，LC-三重串聯(lián)四級(jí)桿（QQQ），LC-傅里葉變換紅外光譜（FTIR）-MS，超高效液相色譜（UPLC）-飛行時(shí)間（TOF）-MS，紅外等手段廣泛用于PDE-5抑制劑的篩查和鑒定[3-12]。日前國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了1個(gè)藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（編號(hào)2009030），對(duì)緩解體力疲勞類（補(bǔ)腎壯陽(yáng)類）保健食品和中成藥進(jìn)行非法添加化學(xué)藥品的篩查和驗(yàn)證，包括11種化學(xué)藥品，一個(gè)分析周期耗時(shí)45 m in。

本研究利用UPLC快速高效分離分析的特點(diǎn)，結(jié)合四級(jí)桿（Q）-TOF高分辨質(zhì)量分辨的能力，具有極高的選擇性，為保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的篩查和檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的工具，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和高通量的結(jié)合。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器和試劑

美國(guó)安捷倫公司1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀；ML204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；M illipore公司M illi-Q純水儀。Q-TOF定性軟件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。PCDL軟件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

甲醇，MERCK公司，LC-MS級(jí)；乙酸銨，SIGMAALDRICH公司，LC-MS級(jí)；水為M illi-Q純水儀制去離子水。

1.2 對(duì)照品與樣品

西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、偽伐地那非、硫代艾地那非、那紅地那非和育亨賓12種對(duì)照品均來(lái)自TORONTO RESEARCH CHEM ICALS INC，純度大于99%。

8批樣品均來(lái)自于各市食品藥品監(jiān)督管理局市場(chǎng)抽樣。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱；DAD（二極管陣列）檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；掃描波長(zhǎng)范圍190～400 nm，步長(zhǎng)（step）：2 nm。流動(dòng)相：0.1%甲酸-10 mmol乙酸銨水溶液（A）、甲醇（B），流速：0.3 m L/m in；柱溫：30℃。進(jìn)樣體積：1 μL。洗脫梯度：時(shí)間（m in）/B（%）：0 m in 10%，5 min 50%，9 m in 50%，13 m in 70%，15m in 70%，20min 95%。12種對(duì)照品的色譜分離情況見(jiàn)圖1。

圖1 12種對(duì)照品的混標(biāo)一級(jí)提取離子流（EIC）色譜疊加圖

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源（ESI）；毛細(xì)管溫度350℃；干燥氣流量10 L/m in；霧化氣壓力40 psi；噴霧電壓3 500 V；碎裂電壓（fragmentor）電壓135 V；正離子檢測(cè)方式；掃描方式為全掃描一級(jí)質(zhì)譜、全掃描二級(jí)質(zhì)譜。12種緩解體力疲勞類保健食品非法添加化學(xué)物質(zhì)的分子式、準(zhǔn)分子離子精密質(zhì)量、碰撞能量和碎片離子信息如表1所示。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定12種對(duì)照品各約5 mg，分別置10 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為單標(biāo)儲(chǔ)備液。再分別取1 m L單標(biāo)置同一50 m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成含上述各對(duì)照品10 μg/m L的混合標(biāo)樣，供進(jìn)樣分析用。

2.4 供試品溶液的制備

若供試品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細(xì)后轉(zhuǎn)移至10 m L量瓶中，加甲醇約8 m L，超聲處理15 m in，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取適量上清液，10 000 rpm離心5 min，取上清液100 μL用甲醇稀釋至1 m L，即得。

若供試品為液體制劑，精密量取2 m L，置10 m L量瓶中，加甲醇約8 m L，振搖3 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。量取續(xù)濾液適量于離心管中，10 000 rpm離心5 m in，取上清液100 μL用甲醇稀釋至1 m L，即得。

表1 12種非法添加化學(xué)物質(zhì)分子式、準(zhǔn)分子離子精密質(zhì)量、碰撞能量和碎片離子

由于供試品檢測(cè)前的濃度未知，故若其檢測(cè)濃度超出方法的線性范圍，則用甲醇進(jìn)行稀釋，以稀釋后溶液進(jìn)行定量。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)方法的專屬性、線性范圍和檢出限、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行了考察。對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋后按上述液質(zhì)聯(lián)用條件測(cè)定，按信噪比S/N=3計(jì)算各化合物的檢出限，各成分檢出限在2.170～53.57 ng/m L。取同一濃度混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算一級(jí)EIC圖譜中峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)精密度。取12種對(duì)照品混標(biāo)溶液，分別稀釋，配制成含12種對(duì)照品各2，5，10，20，50，80 μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸。取陰性樣品1次服用量的內(nèi)容物6份，分別加入一定量對(duì)照品，按樣品處理方法同法處理測(cè)定回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12種非法添加化學(xué)物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

4 樣品測(cè)定

將市場(chǎng)上抽查的8批樣品，按照2.4方法處理樣品，并用UPLC-二極管陣列檢測(cè)（DAD）-Q-TOF-MS/MS處理樣品。比較樣品和對(duì)照品的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜掃描圖，結(jié)合DAD光譜圖，判斷樣品中是否含有非法添加物質(zhì)。結(jié)果如表3所示，在8種樣品中3批檢出陽(yáng)性。

5 討論

5.1 色譜條件的優(yōu)化

在12個(gè)PDE-5抑制劑對(duì)照品中，豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非分別為兩組分子式相同的物質(zhì)，其準(zhǔn)分子離子[M＋H]+的精密質(zhì)量也相同，故必須在液相色譜上完全分離，本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相梯度和比例進(jìn)行不斷優(yōu)化，最終使得精密質(zhì)量相同的組分完全分離。各化合物的保留時(shí)間均大于5 m in，盡量避免因復(fù)雜基質(zhì)影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象。

5.2 膠囊殼的測(cè)定

由于某些非法商家在膠囊殼中添加抗疲勞類藥物，所以膠囊殼中非法添加化學(xué)物質(zhì)的測(cè)定很有必要。其測(cè)定方法為將膠囊內(nèi)容物取出后，取一定量的膠囊殼按照2.4進(jìn)行同法處理。4批膠囊殼均未檢出非法添加物。

表3 8批樣品信息及測(cè)定結(jié)果

5.3 不同溶劑處理樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)影響的研究

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈作為提取溶劑對(duì)測(cè)得結(jié)果的影響，結(jié)果表明，不同提取溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。

[1]夏俊才.壯陽(yáng)類藥品及保健品中非法添加枸櫞酸西地那非的調(diào)查與分析[J].安徽醫(yī)藥，2005，9（3）：228-229.

[2]Liang Q，Qu J，Luo G，et al.Rapid and reliable determ ination of illegal adulterant in herbal medicines and dietary supplements by LC/MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal，2006，40（2）：305-311.

[3]Patel DN，Li L，Kee CL，et al.Screening of synthetic PDE-5 inhibitorsand their analoguesasadulterants：Analytical techniques and challenges[J].J Pharm Biomed Anal，2014，87：176-190.

[4]Lee ES，Lee JH，Han KM，et al.Simultaneous determination of 38 phosphodiestrase-5 inhibitors in illiciterectile dysfunction products by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2013，83：171-178.

[5]Mans DJ，Callahan RJ，Dunn JD，et al.Rapid-screening detection of acetildenafils，sildenafils and avanafil by ion mobility spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2013，75：153-157.

[6]Shi F，Guo C，Gong L，et al.Application of a high resolution benchtop quadrupole-Orbitrap mass spectrometry for the rapid screening，confirmation and quantification of illegal adulterated phosphodiesterase-5 inhibitors in herbal medicines and dietary supplements[J].J Chromatogr A，2014，1344：91-98.

[7]Lanzarotta A，Crowe JB，W itkowski M，et al.A multidisciplinary approach for the analysis of an adulterated dietary supplement where the active pharmaceutical ingredient was embedded in the capsule shell[J].J Pharm Biomed Anal，2012，67-68：22-27.

[8]Wollein U，Eisenreich W，Schramek N，et al.Identification of novel sildenafil-analogues in an adulterated herbal food supplement[J].J Pharm Biomed Anal，2011，56（4）：705-712.

[9]王自.RRLC-Q-TOF-MS法測(cè)定保健食品中11種PDE5抑制劑非法添加[J].臨床合理用藥，2013，6（6）：44-46.

[10]孫灌寧.中成藥保健品中非法添加選擇性磷酸二酯酶-5抑制劑類藥物近況研究[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：56-58.

[11]曲曉宇，董雷，張四喜，等.HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)抗疲勞藥物及保健品中非法添加的7種壯陽(yáng)類化學(xué)藥物[J].中國(guó)藥房，2013，24（33）：3129-3131.

[12]王美玲，曾樂(lè)，顏鴻飛，等.高效液相色譜-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查保健食品中非法添加的磷酸二酯酶-5抑制劑及其類似物[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33（3）：239-247.

Detection of Illegally Added Chem icals in Anti-fatigue Health Foods by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS M ethod

Zhang Yuan1，Hao Gang1，M in Chunyan1，Wu Yang1，Yuan Canyang2，Gu Bingren1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 Ligang Hospital of Jiangyin City，Jiangyin 214444）

Objective:To establish a fast，accurate and sensitive method by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS for the detection of 12 kinds of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods，such as sildenafil，tadalafil，vardenafil，acetildenafil，homosildenafil，hydorxyhomosildenafil，norneosildenafil，am inotadalafil，pseudovardenafil，thioaildenafil. noracetildenafil，and yohimbine.Methods:Agilent ZORBAX Eclipse plus C18analysis column was used with mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate aqueous solution（containing 0.1%form ic acid）-methanol and gradient elution，the flow rate was 0.3m L/m in.ESI+scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analyses were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results:The method was validated.A good linear relationship was showed in the concentration of 2～80 μg/m L，（RSD＜2%）and the recovery was obtained in range of 80.5%～98.7%.Conclusion：This method is fast，accurate and sensitive with a high degree of separation，it can be used as a powerful tool for the fast detection of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Anti-Fatigue Preparations；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.08.004

2014-07-07）

蘇州市科學(xué)技術(shù)局科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（SS201220）

張圓，女，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：zhangyuan213@sina.com

顧炳仁，男，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：944757490@qq.com