改良抗酸染色法在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應用

鄒月麗 白鴿 卜暉 王蓓蕾 田亞楠 錢麗花 王莎 何俊瑛

改良抗酸染色法在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應用

鄒月麗*白鴿*卜暉*王蓓蕾*田亞楠*錢麗花*王莎*何俊瑛*

目的 探討改良抗酸染色法在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應用。方法采用改良抗酸染色法對35例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液進行涂片、染色及鏡檢。結(jié)果35例患者中改良抗酸染色法陽性33例（94.29%），其中有53.40%的標本找到胞內(nèi)抗酸桿菌；非結(jié)核性腦膜炎者15例，其中有1例改良抗酸染色結(jié)果陽性。結(jié)論改良的抗酸染色法顯著提高了腦脊液抗酸桿菌的檢出率，并能發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)抗酸桿菌。因此，改良抗酸染色法可作為早期診斷結(jié)核性腦膜炎的有效檢測手段。

結(jié)核性腦膜炎 改良抗酸染色法 腦脊液

結(jié)核性腦膜炎（簡稱結(jié)腦）是結(jié)核病中受結(jié)核桿菌破壞最嚴重的形式之一，常導致高致殘率及死亡率。故早期診斷并及時給予抗癆藥物治療對于改善結(jié)腦的預后至關重要。但是至今臨床上仍然缺乏有效的診斷方法[1]，這就嚴重影響了結(jié)腦患者的治療及預后，同時制約了實驗室對結(jié)腦的更進一步研究?，F(xiàn)有的方法中，腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)結(jié)核桿菌培養(yǎng)耗時長、需要的腦脊液量大、檢測陽性率很低[2-3]。腦脊液結(jié)核桿菌PCR雖然是一種快速敏感性高的檢測方法，但假陽性率高是這種檢測方法尚無廣泛應用于臨床的重要原因。腦脊液涂片找抗酸桿菌（acid-fast bacilli，AFB）仍是目前用于診斷結(jié)腦最常用的的一種簡便迅速方法，但傳統(tǒng)的抗酸染色法(Ziehl-Neelsen stain,Z-N)陽性率極低，據(jù)報道國內(nèi)外傳統(tǒng)抗酸染色陽性率在10%左右[4-5]。所以，現(xiàn)在急需一種能從少量腦脊液中快速、高敏感的找到結(jié)核分枝桿菌的方法，為臨床結(jié)腦診治及結(jié)腦實驗研究提供依據(jù)，因此我們將128人份腦脊液涂片進行改良抗酸染色法，對鏡檢結(jié)果進行分析，探討改良的抗酸染色法對結(jié)腦診斷及治療中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2012年5月至2012年10月河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的50例臨床懷疑為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，共128人份腦脊液。50例患者中，男31例，女19例，年齡18～81歲，平均（35±6）歲。就診離發(fā)病時間1～56 d，7 d以內(nèi)就診的有14例；7～30 d的有27例；＞30 d就診的有9例。入院后50例患者均嚴格按照臨床診斷標準進行規(guī)范診治。結(jié)腦組臨床診斷標準參考Ahuja等[6-7]臨床診斷標準：①臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、頭痛、嘔吐，持續(xù)時間大于5 d，腦膜刺激征或伴有局灶性神經(jīng)損害，伴或不伴結(jié)核感染的全身中毒癥狀；②腦脊液檢查顯示細胞數(shù)增加(10～500/μL)，淋巴細胞比例＞50%，蛋白＞1 g/L，葡萄糖＜血糖的50%（即＜2.2mmol/L），阿利新蘭染色未見隱球菌及細菌培養(yǎng)陰性；③頭顱CT或MRI檢查存在腦基底池滲出、腦積水、梗死灶或結(jié)核瘤等表現(xiàn)；④存在顱外結(jié)核如肺結(jié)核；⑤除外其他神經(jīng)科疾病。滿足以上①⑤和②③④中任意兩項即可診斷為結(jié)腦。非結(jié)腦組診斷標準參考人民衛(wèi)生出版社第五版《神經(jīng)病學》，其中包括腦膜白血病、化膿性腦膜炎及腦膜癌病。

1.2 研究方法用改良抗酸染色法[8]對所有結(jié)腦患者的腦脊液涂片進行染色，即細胞離心機（Shandon Cytospin,Therm-4,英國）進行集菌、4%多聚甲醛固定、TritonX-100破膜、用傳統(tǒng)抗酸染色劑(天和，杭州)進行染色、最后用光學顯微鏡（OLYMPUS-BX41,日本）進行鏡檢。閱片結(jié)果完全按照國際上公認的修改后的國家結(jié)核病公職規(guī)劃(RNTCP)指南進行統(tǒng)計，將鏡檢結(jié)果共劃分為5個等級：-即100個視野內(nèi)未見AFB；±即100個視野內(nèi)可見1～10條AFB；+即100個視野內(nèi)可見10～100條AFB；++即每個視野內(nèi)可見1～10條AFB；+++即每個視野內(nèi)可見大于10條AFB。我們將結(jié)果為＜（+）者均定為抗酸染色陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料表示用（±s），兩組間率的比較用χ2檢驗，兩組計量資料均數(shù)的比較用t檢驗，檢驗水準為α=0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料按Ahuja等[9]臨床診斷標準，診斷為結(jié)腦者35例，非結(jié)腦者15例，其中腦膜白血病5例，新型隱球菌性腦膜炎5例，化膿性腦膜炎5例。診斷為結(jié)腦的患者均給予規(guī)律的3～5聯(lián)抗結(jié)核治療。35例患者經(jīng)抗結(jié)核治療后34例（97.14%）癥狀和體征有不同程度的好轉(zhuǎn)，其中癥狀明顯好轉(zhuǎn)者26例（74.29%），出院后基本無明顯神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征；癥狀改善者8例（22.86%），出院后仍遺留有不同程度神經(jīng)系統(tǒng)體征；死亡1例（2.86%），死于結(jié)腦的并發(fā)癥(腦疝)。

2.2 改良抗酸染色結(jié)果光鏡下，抗酸桿菌呈散在、并列或成堆分布，治療前或治療初的形態(tài)多為細長略彎曲、線條柔；治療后菌體變?yōu)榇侄虠U狀、大小顆粒，線條不再柔和?？顾釛U菌多為胞外菌，也可見大量胞內(nèi)抗酸桿菌，吞噬菌體的細胞主要為中性粒細胞，也可見到淋巴及單核細胞，胞內(nèi)菌多為粗短桿狀菌，少數(shù)菌形態(tài)為細長略彎曲（圖1）。

35例結(jié)腦患者中，首次腰穿改良抗酸染色陽性者共31例，占88.57%。結(jié)腦組及非結(jié)腦組患者抗酸染色結(jié)果，見表1。細胞內(nèi)抗酸染色檢測結(jié)果見表2。

在抗酸結(jié)果為（+++）的6例中5例腦脊液中性粒細胞比例最高達到60%以上，另外1例中性粒細胞比例最高只達到4%；抗酸結(jié)果為（++）的16例病人腦脊液細胞中中性粒細胞比例最高值的中位數(shù)（M）53.5%，四分位間距（QR）71%,抗酸結(jié)果為（+）的12例患者的腦脊液細胞中中性粒細胞比例最高值的M63%，QR72%?？顾峤Y(jié)果為（±）或（1-）的2例患者，腦脊液細胞學中中性粒細胞比例在整個發(fā)病過程中最高為1%（圖2）。35例結(jié)腦患者其中有8例患者一直隨訪至痊愈，8例患者抗酸陽性持續(xù)時間為病程的第(10～50)d，M為27d（圖3）；其他患者正在隨訪中，最長已隨訪至病程第195d，改良抗酸染色仍陽性。

非結(jié)腦組（共15例）中陰性者共14人，占93.33%：其中1人（++）（表1）。

3 討論

圖1 改良抗酸染色法的陽性結(jié)果（抗酸染色×1000）圖A和B為結(jié)腦患者在未治療或治療初的抗酸染色結(jié)果：抗酸桿菌形態(tài)細長略彎曲、線條柔和，少數(shù)菌呈分節(jié)狀，可見分枝趨勢，圖C和D為胞內(nèi)抗酸桿菌，菌體為粗短桿狀，可見吞噬抗酸桿菌的細胞有中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞，圖E和F顯示的為經(jīng)過治療后的抗酸桿菌，菌體變?yōu)榇侄虠U狀、線條不再柔和，菌體寬度不同程度的增寬及長度不同程度的縮短

圖2 結(jié)腦組病人腦脊液中性粒細胞比例最高值分布表

結(jié)核性腦膜炎發(fā)病率持高不下，從腦脊液中找到結(jié)核分枝桿菌為診斷結(jié)腦的“金標準”?？顾嵬科旧谂R床上應用最廣泛，但由于結(jié)核分支桿菌菌體內(nèi)含有大量類脂質(zhì)，占結(jié)核菌干重的60%，細胞壁內(nèi)含量最多，且其富脂外壁的疏水性之故，一般的染色劑難以滲入，對外界條件有異常大的抵抗力；此外，腦脊液中含菌量極少，故使傳統(tǒng)的抗酸染色法陽性率極低，遠遠不能滿足臨床結(jié)腦診斷的要求。本文針對此難題，將傳統(tǒng)抗酸染色法進行改良，旨在提高抗酸染色的檢出率，并能檢出胞內(nèi)抗酸桿菌。

表1 改良抗酸染色的結(jié)果

表2：胞內(nèi)抗酸桿菌結(jié)果

本研究主要從以下兩方面進行。首先，結(jié)核分枝桿菌為兼性胞內(nèi)菌，即既有細胞外狀態(tài)又有細胞內(nèi)狀態(tài)，故為提高胞外結(jié)核桿菌的檢出率，并同時檢出胞內(nèi)菌，我們將傳統(tǒng)的試管離心法4000 r/min 20～30min的離心條件進行改變，采用細胞收集法，并將離心力及時間適度縮減，使采用少量腦脊液即可將結(jié)核桿菌均勻的收集載玻片上，并保證了細胞的完整性，以至于可以檢出已被吞噬到細胞內(nèi)的胞內(nèi)菌。其次，針對結(jié)核桿菌的細胞壁富含脂質(zhì)，TritonX-100是一種非離子型表面活性劑，通過它溶解脂質(zhì)，增加細胞壁對染色劑的通透性，提高染色的陽性率，故先用TritonX-100在染色之前對標本進行預處理，預處理之后進行抗酸染色。本文中的改良抗酸染色法將抗酸染色的檢出率由以往的10%提高至88.57%，若在整個病程中多次腰穿行改良抗酸染色法，可將檢出率提高至94.29%。同時改善了傳統(tǒng)方法不能檢出胞內(nèi)菌的窘?jīng)r，在檢出抗酸桿菌的標本中，53.15%的標本均檢出胞內(nèi)抗酸桿菌，Chen等[8]也報道過同樣的結(jié)果，他們對48份結(jié)腦患者的腦脊液進行改良抗酸染色，用特異性熒光染料分別對抗酸桿菌、中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞進行標記，通過激光共聚焦顯微鏡進行掃描立體定位，發(fā)現(xiàn)三種細胞均吞噬了抗酸桿菌的現(xiàn)象。傳統(tǒng)抗酸染色法往往在患者接受抗癆治療后1周就不能檢出抗酸桿菌，本文中的此種改良抗酸染色法檢出抗酸桿菌的時間延長至27 d左右，最長的為患者在接受抗癆治療6個半月時腦脊液中仍能檢出抗酸桿菌。因此，將細胞離心法與TritonX-100破膜技術(shù)相結(jié)合，明顯提高了胞外抗酸桿菌的檢出率,也能檢出胞內(nèi)抗酸桿菌，并可將抗酸桿菌的檢出時間延長。

抗酸的陽性程度可能與腦脊液中中性粒細胞的比例關系密切，Marzia等[10]分析了22例結(jié)腦患者腦脊液中中性粒細胞比例與CSF結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性的關系,此22例患者腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)均陽性，其中有94%的患者腦脊液細胞學是以嗜中性粒細胞為主，提出嗜中性粒細胞比例的增高與結(jié)核桿菌的存在有密切關系。本實驗中抗酸結(jié)果（+++）的6例患者中有5例患者腦脊液中性粒細胞的最高值均達到60%以上。

總之，改良抗酸染色法明顯提高了腦脊液中抗酸桿菌的檢出率，既能檢出細胞外抗酸桿菌也可檢出胞內(nèi)抗酸桿菌，并延長了檢出抗酸桿菌的時間。但我們?nèi)杂胁蛔阒?。首先，改良抗酸染色法檢出的只為抗酸桿菌，不能確定為結(jié)核分枝桿菌，也不能證明此菌是致病狀態(tài)還是潛伏感染狀態(tài)，故仍需做進一步研究來證實抗酸桿菌為致病性結(jié)核分枝桿菌；其次，本組資料非結(jié)腦組中有1例改良抗酸染色陽性，考慮原因為該例患者為新型隱球菌性腦膜炎，在首次腰穿送檢腦脊液細胞學后發(fā)現(xiàn)大量新型隱球菌，故臨床診斷為新型隱球菌性腦膜炎，并未考慮合并其他感染的可能，而新型隱球菌性腦膜炎患者大多是在機體免疫功能較差的條件下感染的，因此可能也會增加結(jié)核感染的機會，故此例患者可能同時合并結(jié)核桿菌的感染。另外，目前鮮有文獻報道淋巴細胞的吞噬功能，故尚需不斷研究來解釋淋巴細胞吞噬的原理。

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Evaluation on a modified Ziehl-Neelsen stainin the diagnosis of tuberculous meningitis.

ZOU Yueli,BAI Ge, PU Hui,WANG Beilei,TIAN Yanan,QIAN Lihua,WANG Sha,HE Junying.
Department of Neurology,the Second Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050000,China.Tel:0311-66003711-211.

ObjectiveToevaluateamodified Ziehl-Neelsen(Z-N)stain in the diagnosis of tuberculousmeningitis.MethodsCerebrospinal fluid specimens from 35 patientswere stained by using themodified Ziehl-Neelsen staining.ResultsThe positive rate was 94.29%in 35 patients with tuberculousmeningitisand the intracellular acid-fast bacilliwas detected in 53.40% of all specimens.One casewas stained positive in 15 patients with non-tuberculousmeningitis.ConclusionThemodified Ziehl-Neelsen stain notonly significantly improves the detection rates of tuberculousmeningitisbut alsois able to identify intracellular M.tuberculosisin cerebrospinal fluidspecimen.Thus,themodified Z-N stain can be a convenient tool for diagnosing tuberculousmeningitis.

Tuberculousmeningitis Modified Ziehl-Neelsen stain Cerebrospinal fluid

R529.3

A

2013-01-08）

（責任編輯：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.03.005

*河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(石家莊 050000)