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    L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化

    2014-04-26 11:33蒙滋滋鐘國強涂榮會何艷黎慶捷李爍
    中國實用醫(yī)藥 2014年7期
    關鍵詞:鈣超載鈣通道內(nèi)參

    蒙滋滋 鐘國強 涂榮會 何艷 黎慶捷 李爍

    【摘要】 目的 研究L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化。方法 收集42例行風濕性心臟病瓣膜置換術患者右心房組織作為標本, 其中慢性心房顫動患者22例, 竇性心律患者20例, 分別作為慢性心房顫動組和竇性心律組。應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測L型鈣通道β2亞基的mRNA表達, 以及用Western Blot方法檢測L型鈣通道β2亞基的蛋白表達。結果 與竇性心律組比較, 慢性心房顫動組中L型鈣通道β2亞基在mRNA及蛋白水平的表達則均較竇性心律組顯著上調(diào)(P<0.05)。結論 慢性心房顫動組心房組織中L型鈣通道β2亞基的表達上調(diào), 從而影響心房顫動的發(fā)生和維持。

    【關鍵詞】 L型鈣通道β2亞基;心房顫動;右心房組織

    心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一, 目前房顫的作用機制尚不清楚。因此, 積極尋找新的靶點對臨床房顫的防治十分重要。L型鈣通道β2亞基(CACNB2)在人心肌中表達[1], 并對房顫的發(fā)生有著密切聯(lián)系[2], 但是目前關于CACNB2的研究較少, 本文就CACNB2在心房顫動中的mRNA及蛋白水平的表達進行研究, 探討其表達變化在房顫中的影響。

    1 資料與方法

    1. 1 一般資料 選擇于2012年8月~2013年5月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科住院行風濕性心臟病瓣膜置換術的患者42例, 其中房顫患者22例(房顫病史>6個月), 竇性心律(竇律)患者20例, 分別作為慢性房顫(CAF)組和正常竇律(NSR)組。所選病例年齡、性別、手術方式并無統(tǒng)計學差異。病例選擇排除標準:①口服鈣離子拮抗劑患者;②有感染性心內(nèi)膜炎;③臨床上有風濕性活動征象;④年齡>55歲或<18歲。⑤患有糖尿病, 嚴重肝腎疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。

    1. 2 標本采集和保存 所選病例于體外循環(huán)建立時取約100 mg右心房組織放入無RNA酶的凍存管中并迅速置于液氮中保存。

    1. 3 主要試劑 Trizol(invitrogen), 逆轉錄試劑盒(Fermantas#k 1622), 一抗(Santa Cruz, sc-81890), 二抗(北京中彬金橋, ZB-2305), 內(nèi)參抗體(上??党缮锕?, KC-5G5)。

    1. 4 實驗方法

    1. 4. 1 qRT-PCR檢測 ①取約50 mg右心房組織加入Trizol試劑中勻漿提取總RNA, 并將提取好的RNA溶解于DEPC水中, 于紫外分光光度儀測定濃度和OD值, 所有樣本總RNA的OD值均在1.8~2.0范圍內(nèi)。將總RNA按Fermantas逆轉錄試劑盒#k1622說明書進行逆轉錄合成cDNA。②引物由上海生工生物有限公司代為設計合成CACNB2 Forward primer:5'-ATGCGAGCAGGACGTCGA-3',CACNB2 Reverse primer:5'-TTAGAGCGGCTCCACTTGG-3';β-actin Forward primer:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';β-actin Reverse primer:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。③qRT-PCR檢測:使用SYBR Green 1染料法進行相對定量。qRT-PCR使用儀器為美國AB7500實時熒光定量PCR儀。CACNB2及β-actin反應條件:95°變性10 min, 95°變性15 s, 58°退火45 s, 72°延伸30 s, 共40個循環(huán), 72°延伸10 min。④根據(jù)目的和內(nèi)參所得的Ct值, 用內(nèi)參做標準化處理, 計算2-△△ct值以進行相對定量, 計算所得值用相對于竇律組表達的倍數(shù)來表示。

    1. 4. 2 Western Blot檢測 ①取約50 mg右心房組織放入RIPA裂解液中, 并加入蛋白酶抑制劑后進行勻漿。提取總蛋白后, 用BCA試劑盒測定蛋白濃度。②取等量蛋白上樣進行電泳(10%分離膠, 5%濃縮膠), 用0.45 mmPVDF膜進行轉膜, 5%TBST牛奶封閉, 目的一抗及內(nèi)參GAPDH孵育過夜, 二抗孵育1 h。③為了校正上樣量及曝光時間造成的差異, 顯影時采用GAPDH作為內(nèi)參, 每個條帶均同時檢測GAPDH的表達量。各條帶CACNB2的相對表達量為CACNB2灰度值/GAPDH的灰度值。

    1. 5 統(tǒng)計學方法 所有計量資料用( x-±s)表示, 用SPSS16.0軟件, 兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2. 1 CACNB2的qRT-PCR結果 組間CACNB2的比較, 慢性房顫組較正常竇律組明顯上調(diào)[(1.9783±0.3231)VS (0.7215±0.4021), P<0.05], 差異有統(tǒng)計學意義。

    2. 2 CACNB2的Western Blot結果 經(jīng)過軟件獲取條帶的灰度值, 計算目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH的灰度值之比, 進行相對半定量分析, CACNB2在房顫組中蛋白表達顯著高于正常竇律組[(1.35±0.20)VS(1.07±0.23), P<0.05]。結果如圖1所示, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    3 討論

    心房顫動是常見的心律失常之一, 目前發(fā)病機制尚未清楚。近年研究表明, 心房顫動與心房肌的有效不應期縮短有關[3], 主要為動作電位2期平臺期的縮短, 而此期ICaL作為與鉀離子通道電流拮抗的電流[4], 在心房顫動中起重要作用。風濕性因素對于L型鈣通道的表達無直接影響 。Yue等在房顫犬模型的研究中提出IcaL降低[5], 此后亦有不少文獻作相關報道。對慢性房顫的研究中, 目前鈣超載是房顫的發(fā)生和維持的主要機制之一, 是電重構的重要環(huán)節(jié)[6]。L型鈣通道在鈣電流變化中起重要作用。L型鈣通道β亞基有四種亞型, 只有β2亞基在心肌表達 [1]。本研究通過RT-PCR和Western Blot可知, 房顫組mRNA及蛋白表達高于竇律組, 即CACNB2表達發(fā)生了上調(diào), 此結果與Schotten的報道相似。Schotten等[7]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性房顫患者心肌L型鈣通道β2a亞基的表達并不下調(diào), 所以, 房顫時IcaL降低可能與其他亞基或者亞型的下調(diào)或表達異常有關。本實驗研究的是慢性房顫患者右心耳組織中L型鈣通道β2亞基的表達, 而在既往的研究中鮮有相關報道。endprint

    CACNB2表達發(fā)生上調(diào), 可使L型鈣通道活性增強, 加速L型鈣通道激活, 增加鈣電流,促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高, 發(fā)生了鈣超載, 導致L型鈣通道本身加速失活, IcaL降低, 有效不應期縮短, 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關, 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9], 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載, 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變, 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

    參考文獻

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    CACNB2表達發(fā)生上調(diào), 可使L型鈣通道活性增強, 加速L型鈣通道激活, 增加鈣電流,促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高, 發(fā)生了鈣超載, 導致L型鈣通道本身加速失活, IcaL降低, 有效不應期縮短, 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關, 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9], 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載, 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變, 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

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    CACNB2表達發(fā)生上調(diào), 可使L型鈣通道活性增強, 加速L型鈣通道激活, 增加鈣電流,促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高, 發(fā)生了鈣超載, 導致L型鈣通道本身加速失活, IcaL降低, 有效不應期縮短, 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關, 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9], 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載, 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變, 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

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