L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化

蒙滋滋　鐘國強　涂榮會　何艷　黎慶捷　李爍

【摘要】 目的 研究L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化。方法 收集42例行風濕性心臟病瓣膜置換術患者右心房組織作為標本， 其中慢性心房顫動患者22例， 竇性心律患者20例， 分別作為慢性心房顫動組和竇性心律組。應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測L型鈣通道β2亞基的mRNA表達， 以及用Western Blot方法檢測L型鈣通道β2亞基的蛋白表達。結果 與竇性心律組比較， 慢性心房顫動組中L型鈣通道β2亞基在mRNA及蛋白水平的表達則均較竇性心律組顯著上調(diào)（P<0.05）。結論 慢性心房顫動組心房組織中L型鈣通道β2亞基的表達上調(diào)， 從而影響心房顫動的發(fā)生和維持。

【關鍵詞】 L型鈣通道β2亞基；心房顫動；右心房組織

心房顫動（房顫）是臨床上最常見的心律失常之一， 目前房顫的作用機制尚不清楚。因此， 積極尋找新的靶點對臨床房顫的防治十分重要。L型鈣通道β2亞基（CACNB2）在人心肌中表達[1]， 并對房顫的發(fā)生有著密切聯(lián)系[2]， 但是目前關于CACNB2的研究較少， 本文就CACNB2在心房顫動中的mRNA及蛋白水平的表達進行研究， 探討其表達變化在房顫中的影響。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇于2012年8月～2013年5月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科住院行風濕性心臟病瓣膜置換術的患者42例， 其中房顫患者22例（房顫病史>6個月）， 竇性心律（竇律）患者20例， 分別作為慢性房顫（CAF）組和正常竇律（NSR）組。所選病例年齡、性別、手術方式并無統(tǒng)計學差異。病例選擇排除標準：①口服鈣離子拮抗劑患者；②有感染性心內(nèi)膜炎；③臨床上有風濕性活動征象；④年齡>55歲或<18歲。⑤患有糖尿病， 嚴重肝腎疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。

1. 2 標本采集和保存 所選病例于體外循環(huán)建立時取約100 mg右心房組織放入無RNA酶的凍存管中并迅速置于液氮中保存。

1. 3 主要試劑 Trizol（invitrogen）， 逆轉錄試劑盒（Fermantas#k 1622）， 一抗（Santa Cruz， sc-81890）， 二抗（北京中彬金橋， ZB-2305）， 內(nèi)參抗體（上?？党缮锕?， KC-5G5）。

1. 4 實驗方法

1. 4. 1 qRT-PCR檢測 ①取約50 mg右心房組織加入Trizol試劑中勻漿提取總RNA， 并將提取好的RNA溶解于DEPC水中， 于紫外分光光度儀測定濃度和OD值， 所有樣本總RNA的OD值均在1.8～2.0范圍內(nèi)。將總RNA按Fermantas逆轉錄試劑盒#k1622說明書進行逆轉錄合成cDNA。②引物由上海生工生物有限公司代為設計合成CACNB2 Forward primer：5'-ATGCGAGCAGGACGTCGA-3'，CACNB2 Reverse primer：5'-TTAGAGCGGCTCCACTTGG-3'；β-actin Forward primer：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；β-actin Reverse primer：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。③qRT-PCR檢測：使用SYBR Green 1染料法進行相對定量。qRT-PCR使用儀器為美國AB7500實時熒光定量PCR儀。CACNB2及β-actin反應條件：95°變性10 min， 95°變性15 s， 58°退火45 s， 72°延伸30 s， 共40個循環(huán)， 72°延伸10 min。④根據(jù)目的和內(nèi)參所得的Ct值， 用內(nèi)參做標準化處理， 計算2-△△ct值以進行相對定量， 計算所得值用相對于竇律組表達的倍數(shù)來表示。

1. 4. 2 Western Blot檢測 ①取約50 mg右心房組織放入RIPA裂解液中， 并加入蛋白酶抑制劑后進行勻漿。提取總蛋白后， 用BCA試劑盒測定蛋白濃度。②取等量蛋白上樣進行電泳（10%分離膠， 5%濃縮膠）， 用0.45 mmPVDF膜進行轉膜， 5%TBST牛奶封閉， 目的一抗及內(nèi)參GAPDH孵育過夜， 二抗孵育1 h。③為了校正上樣量及曝光時間造成的差異， 顯影時采用GAPDH作為內(nèi)參， 每個條帶均同時檢測GAPDH的表達量。各條帶CACNB2的相對表達量為CACNB2灰度值/GAPDH的灰度值。

1. 5 統(tǒng)計學方法 所有計量資料用（ x-±s）表示， 用SPSS16.0軟件， 兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 CACNB2的qRT-PCR結果 組間CACNB2的比較， 慢性房顫組較正常竇律組明顯上調(diào)[（1.9783±0.3231）VS （0.7215±0.4021）， P<0.05]， 差異有統(tǒng)計學意義。

2. 2 CACNB2的Western Blot結果 經(jīng)過軟件獲取條帶的灰度值， 計算目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH的灰度值之比， 進行相對半定量分析， CACNB2在房顫組中蛋白表達顯著高于正常竇律組[（1.35±0.20）VS（1.07±0.23）， P<0.05]。結果如圖1所示， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

心房顫動是常見的心律失常之一， 目前發(fā)病機制尚未清楚。近年研究表明， 心房顫動與心房肌的有效不應期縮短有關[3]， 主要為動作電位2期平臺期的縮短， 而此期ICaL作為與鉀離子通道電流拮抗的電流[4]， 在心房顫動中起重要作用。風濕性因素對于L型鈣通道的表達無直接影響 。Yue等在房顫犬模型的研究中提出IcaL降低[5]， 此后亦有不少文獻作相關報道。對慢性房顫的研究中， 目前鈣超載是房顫的發(fā)生和維持的主要機制之一， 是電重構的重要環(huán)節(jié)[6]。L型鈣通道在鈣電流變化中起重要作用。L型鈣通道β亞基有四種亞型， 只有β2亞基在心肌表達 [1]。本研究通過RT-PCR和Western Blot可知， 房顫組mRNA及蛋白表達高于竇律組， 即CACNB2表達發(fā)生了上調(diào)， 此結果與Schotten的報道相似。Schotten等[7]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性房顫患者心肌L型鈣通道β2a亞基的表達并不下調(diào)， 所以， 房顫時IcaL降低可能與其他亞基或者亞型的下調(diào)或表達異常有關。本實驗研究的是慢性房顫患者右心耳組織中L型鈣通道β2亞基的表達， 而在既往的研究中鮮有相關報道。endprint

CACNB2表達發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應期縮短， 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關， 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9]， 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載， 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變， 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

參考文獻

[1] Bodi I， Mikala G， Koch SE， et al. The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on. Clin InVest， 2005（115）：3306-3317.

[2] Antzelevitch C， Pollevick GD， Cordeiro JM，et al.Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation， short QT intervals， and sudden cardiac death. Circulation， 2007，115（4）：442-449.

[3] Wijffels MC， Kirchhof CJ， Dorland R， et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats.Circulation， 1995（92）：1954-1968.

[4] Van Wagoner DR， Pond AL， Lamorgese M， et al. Atrial L-type Ca2+ currents and human atrial fibrillation. Circ Res， 1999，85（5）：428-436.

[5] Shi YQ， Yang C， Ding WJ， et al.Changes of the mRNA and protein expression of α1 subunit of L-type and T-type calcium channels in human atrial myocardlum of rheumatic atrial fibrillation patients.Molecular Cardiology of China， 2011，10（1）：11-16.

[6] Allessie M， Ausma J， Schotten U. Electrical， contractile and structural remodeling during atrial fibrillation. Cardiovasc Res， 2002， 54（2）：230-246.

[7] Schotten U， Haase H， Frechen D， et al. The L-type Ca2+ channel subunits alphalC and beta2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation.Jmol Cardiol， 2003， 35（5）：437-443.

[8] Findlay I. Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels： one switch. J Physiol， 2004，554（2）：275-283.

[9] De Leon M，Wang Y， Jones L， et al.Essential Ca（2+）-binding motif for Ca（2+）-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels. Sciense， 1995， 270（5241）：1502-1506.endprint

CACNB2表達發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應期縮短， 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關， 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9]， 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載， 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變， 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

參考文獻

[1] Bodi I， Mikala G， Koch SE， et al. The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on. Clin InVest， 2005（115）：3306-3317.

[2] Antzelevitch C， Pollevick GD， Cordeiro JM，et al.Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation， short QT intervals， and sudden cardiac death. Circulation， 2007，115（4）：442-449.

[3] Wijffels MC， Kirchhof CJ， Dorland R， et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats.Circulation， 1995（92）：1954-1968.

[4] Van Wagoner DR， Pond AL， Lamorgese M， et al. Atrial L-type Ca2+ currents and human atrial fibrillation. Circ Res， 1999，85（5）：428-436.

[5] Shi YQ， Yang C， Ding WJ， et al.Changes of the mRNA and protein expression of α1 subunit of L-type and T-type calcium channels in human atrial myocardlum of rheumatic atrial fibrillation patients.Molecular Cardiology of China， 2011，10（1）：11-16.

[6] Allessie M， Ausma J， Schotten U. Electrical， contractile and structural remodeling during atrial fibrillation. Cardiovasc Res， 2002， 54（2）：230-246.

[7] Schotten U， Haase H， Frechen D， et al. The L-type Ca2+ channel subunits alphalC and beta2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation.Jmol Cardiol， 2003， 35（5）：437-443.

[8] Findlay I. Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels： one switch. J Physiol， 2004，554（2）：275-283.

[9] De Leon M，Wang Y， Jones L， et al.Essential Ca（2+）-binding motif for Ca（2+）-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels. Sciense， 1995， 270（5241）：1502-1506.endprint

CACNB2表達發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應期縮短， 促進房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關， 還與細胞內(nèi)鈣濃度相關[9]， 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內(nèi)鈣超載， 引起細胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變， 進而維持房顫的發(fā)生[5]。

參考文獻

[1] Bodi I， Mikala G， Koch SE， et al. The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on. Clin InVest， 2005（115）：3306-3317.

[2] Antzelevitch C， Pollevick GD， Cordeiro JM，et al.Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation， short QT intervals， and sudden cardiac death. Circulation， 2007，115（4）：442-449.

[3] Wijffels MC， Kirchhof CJ， Dorland R， et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats.Circulation， 1995（92）：1954-1968.

[4] Van Wagoner DR， Pond AL， Lamorgese M， et al. Atrial L-type Ca2+ currents and human atrial fibrillation. Circ Res， 1999，85（5）：428-436.

[5] Shi YQ， Yang C， Ding WJ， et al.Changes of the mRNA and protein expression of α1 subunit of L-type and T-type calcium channels in human atrial myocardlum of rheumatic atrial fibrillation patients.Molecular Cardiology of China， 2011，10（1）：11-16.

[6] Allessie M， Ausma J， Schotten U. Electrical， contractile and structural remodeling during atrial fibrillation. Cardiovasc Res， 2002， 54（2）：230-246.

[7] Schotten U， Haase H， Frechen D， et al. The L-type Ca2+ channel subunits alphalC and beta2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation.Jmol Cardiol， 2003， 35（5）：437-443.

[8] Findlay I. Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels： one switch. J Physiol， 2004，554（2）：275-283.

[9] De Leon M，Wang Y， Jones L， et al.Essential Ca（2+）-binding motif for Ca（2+）-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels. Sciense， 1995， 270（5241）：1502-1506.endprint