藠頭組培快繁技術(shù)研究

李 佳，黃凱敏，郭 濤

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

藠頭(Allium chinensis G.Don)又名薤或蕎頭，是百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)草本植物，適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，在我國(guó)種植已有3700多年的歷史。藠頭具有多種藥理作用［1-8］。據(jù)《本草綱目》記載，藠頭辛、溫、滑、無(wú)毒，主治金瘡敗毒，有輕身、不饑、耐勞之功效，還能預(yù)防多種疾病;同時(shí)，薤白對(duì)提高機(jī)體免疫功能，對(duì)抗免疫損傷及豐富餐桌食品都具有一定意義［2］，是現(xiàn)代綠色保健食品之一，被譽(yù)為“菜中靈芝”;曾有報(bào)道提出藠頭中活性成分有抑癌作用［3-6］，有研究表明，藠頭所含有的 DADS，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)腸癌、皮膚癌［5］、肝癌［6］、乳腺癌［7］和肺癌［8］等都具有明顯的抑制作用。藠頭在日本、新加坡、韓國(guó)、馬來(lái)西亞等國(guó)備受青睞，其加工后的價(jià)值呈幾倍甚至幾十倍地增加。湖北省武漢市江夏區(qū)梁子湖地區(qū)是我國(guó)的藠頭之鄉(xiāng)，有著800多年的種植歷史，經(jīng)加工后的產(chǎn)品出口10多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，已成為日本、韓國(guó)等國(guó)家飲食的必備品，市場(chǎng)逐年穩(wěn)步上升。

然而，藠頭在組織培養(yǎng)方面的研究目前還很少［9，10］，對(duì)該種植物組培中存在的各種問(wèn)題還沒(méi)有深入的研究報(bào)道，在培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)條件的研究還是空白。本文的研究意義就在于對(duì)藠頭在組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)的光照條件對(duì)其的影響，并對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的培養(yǎng)條件，為該植物的組織培養(yǎng)及品種改良提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為藠頭(A.chinensis G.Don)，材料來(lái)源為田間采集。

1.2 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、光照恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 外植體的制備與接種

取藠頭的鱗莖部分，洗去表面塵土，自來(lái)水沖洗3 h左右，軟毛刷刷洗，75%酒精浸泡20 s，0.1%升汞浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗3次，在超凈工作臺(tái)上操作，去根，將鱗莖部分去除外層鱗片，縱切，一分為二，進(jìn)行接種。

1.4 培養(yǎng)基配方

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、NAA和活性炭，另加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH 值 5.8。

生根培養(yǎng)基采用1/2 MS基本培養(yǎng)基，附加0.1 mg/L NAA、1g/L活性炭，其它同上。

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)過(guò)程在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為25℃。

光照條件分3組進(jìn)行，A組為24 h黑暗培養(yǎng)，B組光照周期為8 h光照，16 h黑暗培養(yǎng)，C組為16 h光照，8h黑暗培養(yǎng)。

1.6 煉苗移栽

將根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)良好的組培苗瓶轉(zhuǎn)移至自然光照下，2 d后將瓶蓋半開(kāi)，4—5 d后，小心將組培苗取出，用清水洗凈根系上的殘余培養(yǎng)基，移栽入砂子:腐殖土(1∶1)的混合基質(zhì)中，噴水保濕。注意煉苗期間防止陽(yáng)光直射和基質(zhì)過(guò)濕。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽的外植體的數(shù)目/接種的外植體總數(shù)×100(%)，不定芽平均數(shù)=誘導(dǎo)出芽的數(shù)目/誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)目(個(gè))。數(shù)據(jù)采用正交實(shí)驗(yàn)直觀分析或單因素LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配比對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

將藠頭鱗莖縱切后，按照表1所示的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，垂直接種在不同濃度配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)接種10瓶，每瓶接種5塊外植體，培養(yǎng)4—5 d即可見(jiàn)不定芽萌發(fā)，30 d后不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)表明不同外源激素濃度及活性炭的添加對(duì)藠頭不定芽的誘導(dǎo)均有較大的影響。

表1 藠頭不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

2.1.1 6-BA對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

經(jīng)過(guò)正交分析顯示，不同濃度的6-BA對(duì)藠頭不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽平均值的影響極差分別為6.000和0.626，為三個(gè)影響因素中最大的，因此，6-BA的濃度變化水平對(duì)藠頭不定芽的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用。比較k值，誘導(dǎo)率的作用效果值從大到小為k2＞k1=k3，且數(shù)值上相差不大，均在90以上，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，只要操作規(guī)范，染菌情況控制好，外植體基本都能夠誘導(dǎo)出不定芽(見(jiàn)圖1)。

不定芽平均數(shù)的k值從大到小為k2＞k3＞k1，且差距較大，其中，當(dāng)6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，效果最好，誘導(dǎo)出的不定芽色澤嫩綠、芽多而粗壯(見(jiàn)圖1b)，而6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，雖然大多也能誘導(dǎo)出芽，但數(shù)目少，且芽的色澤黃綠，形態(tài)纖細(xì)(見(jiàn)圖1a)，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，芽的色澤暗綠，形態(tài)粗壯(見(jiàn)圖1c)。因此，分析6-BA濃度的變化主要影響不定芽的數(shù)目和狀態(tài)，對(duì)誘導(dǎo)率影響不大。

2.1.2 NAA對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

不同濃度的NAA對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)率的影響極差為4.667，在三個(gè)因素中排第二位，因此，NAA的添加對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)率同樣有較大的影響，比較k值，誘導(dǎo)率的作用效果值從大到小為k2＞k1＞k3，其中k1和k2在數(shù)值上相差不大，因此認(rèn)為，添加低濃度的NAA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)更為有利，當(dāng)NAA濃度增加時(shí)，不定芽誘導(dǎo)降低，且出現(xiàn)少量愈傷組織。

NAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)平均數(shù)的影響極差為0.073，在三個(gè)因素中排最后，k值也相差不大，因此分析NAA的添加對(duì)不定芽數(shù)目的影響不大。

2.1.3 活性炭對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

不同濃度的活性炭對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)率的影響極差為2.666，在三個(gè)因素中排第三位，因此，活性炭的添加對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)率的影響最小，比較k值，誘導(dǎo)率的作用效果值從大到小為k2＞k1＞k3，三個(gè)數(shù)值相差不大，均在90以上。而對(duì)于不定芽平均數(shù)的影響極差為0.183，排在第二，比較k值，從大到小為k3＞k1＞k2。當(dāng)不添加活性炭時(shí)，不定芽誘導(dǎo)情況良好，色澤嫩綠、形態(tài)纖細(xì)(見(jiàn)圖2a)，然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，芽的長(zhǎng)勢(shì)不佳，易褐化。當(dāng)添加1mg/L活性炭時(shí)，不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，色澤嫩綠、形態(tài)粗壯(見(jiàn)圖2b)，然而芽的數(shù)目有所降低，可能是由于活性炭吸附了部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得外植體營(yíng)養(yǎng)吸收不足，但是，如果及時(shí)轉(zhuǎn)接，則芽的生長(zhǎng)良好。當(dāng)添加2mg/L活性炭時(shí)，不定芽誘導(dǎo)數(shù)目較多，然而芽的狀態(tài)不佳，均較為細(xì)弱，長(zhǎng)勢(shì)緩慢(見(jiàn)圖2c)。

圖2 添加不同濃度的活性炭對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

綜合考慮以上結(jié)果，對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基，附加1.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA和1.0 g/L活性炭，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)率可達(dá)90%以上，不定芽平均數(shù)可達(dá)2.0以上，不定芽色澤嫩綠、形態(tài)粗壯。

2.2 光照條件對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

在固定6-BA、NAA和活性炭的濃度分別為1.0mg/L、0.1mg/L 和 1.0g/L 的情況下，我們對(duì)光照條件對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果進(jìn)行了單因素分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 光照條件對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

在暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)的不同條件下，外植體誘導(dǎo)率有顯著性差異，光照培養(yǎng)的要高，說(shuō)明光照可促進(jìn)外植體芽的誘導(dǎo)，但不定芽平均數(shù)的結(jié)果，二者之間的差異不顯著，而光照下，芽誘導(dǎo)率比暗培養(yǎng)下稍有提高。然而，在暗培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)出的不定芽色澤黃綠、形態(tài)細(xì)弱(見(jiàn)圖3a)，成活率不高。而在光照不足和光照充足的不同培養(yǎng)條件下，外植體誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率均無(wú)顯著差異，然而，在弱光照下，芽的誘導(dǎo)率比強(qiáng)光照下要稍高些。然而，同時(shí)還觀察到，在光照充足的條件下，再生芽的長(zhǎng)勢(shì)比較旺盛(見(jiàn)圖3b)。

圖3 光照條件對(duì)藠頭不定芽誘導(dǎo)的影響

由于考慮到我們接種的藠頭外植體是鱗莖，因此，我們?cè)谒婎^的培養(yǎng)初期(48小時(shí))，采取暗培養(yǎng)，使之在與土壤中相似的暗條件下生長(zhǎng)。48小時(shí)后，將其轉(zhuǎn)到光照8小時(shí)/黑暗16小時(shí)下培養(yǎng)，4—5 d后即可誘導(dǎo)出較多的芽，大約一周后，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)下培養(yǎng)，誘導(dǎo)出的芽在充足的光照下生長(zhǎng)旺盛。

2.3 藠頭不定芽生根培養(yǎng)及煉苗移栽

在培養(yǎng)30 d后，選取嫩綠、粗壯的不定芽，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，5 d左右發(fā)現(xiàn)有根生成，15 d后，根生長(zhǎng)良好，并有毛狀根生成。此時(shí)，可將根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)良好的組培苗進(jìn)行煉苗移栽，成活率可達(dá)90%左右。

3 討論

正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-BA對(duì)藠頭的不定芽影響最為顯著，NAA的影響較小，說(shuō)明細(xì)胞分裂素對(duì)藠頭的芽的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，然而應(yīng)控制在一定的濃度下，濃度過(guò)高時(shí)，則芽的狀態(tài)不佳，色澤暗沉，成活率不高，因此，選擇適當(dāng)?shù)臐舛仁堑玫礁哔|(zhì)量芽的關(guān)鍵。

活性炭的添加對(duì)于不定芽的數(shù)目影響不大，而對(duì)誘導(dǎo)率有一定的影響，分析原因，可能是因?yàn)榛钚蕴课搅送庵搀w分泌的一些毒性物質(zhì)，可防止外植體褐化，同時(shí)可以模仿植物體自然的生長(zhǎng)狀態(tài)下的土壤環(huán)境，有利于不定芽的誘導(dǎo)。

光照條件對(duì)于藠頭的不定芽誘導(dǎo)率有顯著性的影響，當(dāng)光照充足時(shí)，誘導(dǎo)率明顯增加，然而，若培養(yǎng)初期光照過(guò)強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則不定芽的狀態(tài)較差，且較易褐化。有報(bào)道顯示，在用光誘導(dǎo)器官形成時(shí)，并不要求很強(qiáng)的光，對(duì)多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，每天16 h的光照是適宜的［11］。因此，本研究采取以下方法，培養(yǎng)初期的48 h為黑暗培養(yǎng)，此時(shí)為不定芽誘導(dǎo)初始的關(guān)鍵時(shí)期，黑暗培養(yǎng)可有助于芽器官的形態(tài)建成，之后轉(zhuǎn)到光照8 h/黑暗16 h下培養(yǎng)，此時(shí)的弱光照可起到光誘導(dǎo)的作用，使得芽的形態(tài)進(jìn)一步形成，一周后，轉(zhuǎn)到光照16h/黑暗8h下培養(yǎng)，長(zhǎng)成的芽可在充足的光照下旺盛生長(zhǎng)，采用此方法可誘導(dǎo)出質(zhì)量較高的不定芽。

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