HPLC法測(cè)定痛痹康膠囊中士的寧含量

施 猛，任亞東，肖 艷，劉志強(qiáng)

(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510663)

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HPLC法測(cè)定痛痹康膠囊中士的寧含量

施 猛，任亞東*，肖 艷，劉志強(qiáng)

(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510663)

目的：建立痛痹康膠囊中士的寧的含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。方法：采用高效液相法，色譜柱采用正相硅膠柱(4.6mm×250mm，5μm) ，以正己烷-二氯甲烷-無水甲醇-三乙胺(47.5∶47.5∶5∶0.4)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：士的寧的回歸方程為y=7.108 34x-21.971 91,r=0.999 86，其在31.00～387.40μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101.8%(n=6)，RSD值為2.15%；樣品中士的寧的平均含量為0.19 mg/粒。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，可用于該制劑中士的寧含量的檢測(cè)。

痛痹康膠囊；士的寧；含量測(cè)定

痛痹康膠囊(原名：仲香膠囊)是在清代《急救應(yīng)驗(yàn)良方》九分散的基礎(chǔ)上加味而成，共由十一味中藥材(制馬錢子、麻黃、乳香、沒藥等)組成[1]。痛痹康膠囊為中藥六類新藥，目前三期臨床試驗(yàn)已完成，主要用于治療腰錐間盤突出癥引起的腰腿疼痛、下肢麻木等，其總體有效率可達(dá)90%以上。

中藥及其制劑的內(nèi)在穩(wěn)定性是中藥現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵點(diǎn)之一。方中的君藥為制馬錢子，其主要成分為馬錢子堿和士的寧，其中士的寧既是有效成分又是毒性成分。為保證臨床用藥安全、有效，應(yīng)當(dāng)合理控制方中士的寧的含量[2]。筆者采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)該制劑中的有效成分士的寧進(jìn)行了含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀(Agilent 公司);PDAD光電二極管陣列檢測(cè)器(Agilent 公司);梅特勒XS205 電子天平(梅特勒公司)。

1.2 試藥

樣品：痛痹康膠囊(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)自制，批號(hào)：48120501；48120601；48120602)；對(duì)照品：士的寧，含量為97%(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110705-200306)；正己烷、二氯甲烷、無水甲醇為色譜純；三乙胺、三氯甲烷、乙酸乙酯、氫氧化鈉、氨水為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ECOSIL硅膠柱( 4.6mm × 250mm，5μm) ，流動(dòng)相：正己烷-二氯甲烷-無水甲醇-三乙胺(47.5∶47.5∶5∶0.4)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取士的寧(五氧化二磷減壓干燥12h)對(duì)照品約40mg，置于100mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL，置于25mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備方法

取痛痹康膠囊顆粒約5.0g，精密稱定，加氫氧化鈉溶液15mL使之溶解，放置30min，精密加入三氯甲烷50mL，稱定重量，超聲60min(每10min振搖1次)，放冷，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，分取三氯甲烷層，濾過。精密量取續(xù)濾液20mL，置于水浴中蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴ト芙?，轉(zhuǎn)移并定容至10mL，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算士的寧含量。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和專屬性試驗(yàn)

參照痛痹康膠囊處方制備不含馬錢子的陰性樣品，研細(xì)，按照“2.3”項(xiàng)所述方法處理，制備陰性對(duì)照溶液。取流動(dòng)相用0.45μm微孔濾膜過濾作為空白樣品。精密量取空白樣品、陰性對(duì)照樣品、供試品溶液及對(duì)照品溶液各10μL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜，見圖1。

結(jié)果表明，空白樣品和陰性樣品在士的寧對(duì)照品保留時(shí)間處無干擾，樣品色譜中士的寧與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，士的寧的理論塔板數(shù)為14 159，均符合要求，該方法具有檢測(cè)士的寧的專屬性。

3.2 精密度

精密量取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品峰面積。結(jié)果表明其平均峰面積為1 074.296，RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

3.3 線性關(guān)系考察

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2、3、5、10、20mL，分別置于25mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為31.00、46.50、77.50、155.00、310.00μg/mL的系列溶液。分別精密量取上述對(duì)照品系列濃度的溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備液各10μL，按照“2.1”所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，士的寧質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=7.108 34x-21.971 91，r=0.999 86。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，士的寧在31.00～387.40μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批號(hào)的痛痹康膠囊樣品6份，精密稱定，按照供試品溶液制備方法處理，并按照“2.1”所述的士的寧含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果表明，樣品中士的寧平均含量為0.546mg/g，RSD為2.0%，該方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h測(cè)定士的寧峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，平均峰面積為721.068，RSD為1.52%，樣品在24h內(nèi)無明顯變化。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取痛痹康膠囊樣品6份，約2.5g，分別精密加入等量對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法處理，并按照“2.1”所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法測(cè)得的加樣回收率在95%～105%之間，RSD為2.15%，回收率符合要求。

3.7 樣品含量測(cè)定

取痛痹康膠囊樣品3批，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件依次測(cè)定,計(jì)算士的寧含量，結(jié)果見表2。測(cè)得痛痹康膠囊中士的寧的平均含量為0.19mg/粒，符合規(guī)定。

表2 樣品中士的寧含量測(cè)定結(jié)果

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

4 討論

筆者參考了《中國(guó)藥典》2010年版[3]馬錢子藥材中士的寧的含量測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)。針對(duì)該制劑的特點(diǎn)，主要對(duì)含量測(cè)定方法中液相色譜的流動(dòng)相組成和供試品溶液制備方法進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。

筆者將士的寧對(duì)照品溶液在250～320nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)士的寧在280nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。藥典中測(cè)定士的寧含量使用的流動(dòng)相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào) pH 至2.8)?？紤]到庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑且價(jià)格昂貴，且液相平衡時(shí)間較長(zhǎng)，色譜洗脫步驟繁瑣。文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道，當(dāng)在流動(dòng)相中加入三乙胺后，色譜峰峰形和分離度均得到了明顯改善。王亞靜[6]采用C8柱，以甲醇-水-冰醋酸( 100∶480∶35，用三乙胺調(diào)pH3.2) 為流動(dòng)相時(shí)，能使樣品中的士的寧與馬錢子堿分離開來，說明采用三乙胺調(diào)pH值也是一種有效的方法，其他文獻(xiàn)也有類似報(bào)道[7]。因此，參考上述文獻(xiàn)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，選擇了正相硅膠柱，以正己烷-二氯甲烷-無水甲醇-三乙胺(47.5∶47.5∶5∶0.4)為流動(dòng)相，可使士的寧的峰形和分離度都較好。

圖1 痛痹康膠囊高效液相色譜

此外，筆者還考察了供試品溶液制備方法中不同超聲提取時(shí)間對(duì)士的寧含量的影響，發(fā)現(xiàn)考察的四種提取時(shí)間的士的寧含量分別為0.277mg/mL、0.354mg/mL、0.344mg/mL、0.277mg/mL，說明超聲提取時(shí)間對(duì)士的寧的含量有一定影響，故選擇士的寧含量最高的60min。

綜上所述，該方法精密度好，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，可用于痛痹康膠囊中士的寧的含量測(cè)定及該制劑的質(zhì)量控制。

[1] 張錫瑋,李國(guó)信,盧春玲,等.仲香膠囊Ⅰ期臨床耐受性研究[J].中國(guó)新藥雜志,2009,18(5):424-426.

[2] 房丹,劉維,劉曉亞,等.馬錢子藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(7):1018-1020.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:48.

[4] 孫凌,李永吉,王艷宏,等.高效液相色譜法測(cè)定接骨挫膠囊中士的寧含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(16):98-99.

[5] 周玲,孫漢斌,鄧旭坤,等.高效液相色譜法測(cè)定3種馬錢屬藥材中士的寧和馬錢子堿的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2012,32(16):1301-1302.

[6] 王亞靜.HPLC同時(shí)測(cè)定腰痛寧貼片中的士的寧和馬錢子堿[J].華西藥學(xué)雜志,2001,26(1):73-74.

[7] 張丹,王之梅,顏學(xué)偉,等.HPLC法測(cè)定偏癱康復(fù)液中士的寧和馬錢子堿的含量[J].中國(guó)新藥與臨床藥理,2012,23(3):335-338.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Content Determination of Strychnine in TongBikang Capsule by HPLC

Shi Meng,Ren Yandong*,Xiao Yan,Liu Zhiqiang

(Yangze River Pharmaceutical Group ,Guangzhou Hairui pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangzhou 510663, china)

Objective:To establish a method for the determination of strychnine in TongBikang capsule, thus to provide a scientific basis for its quality control.Methods:HPLC method was adopted. These separation was performed on Ecosil HPLC column with mobile phase consisted of Hexane-dichloromethane-anhydrous methanol-triethylamine (47.5∶47.5∶5∶0.4) at the flow rate of 1.0mL/min. The detection wavelength was set at 280nm and the injection volume was 10μL.Results:The linear range of strychnine was 31.00～387.40μg/mL (r=0.999 86) with an average recovery of 101.8% (RSD=2.15%, n=6) . The average concentration of strychnine was 0.19mg/tables.Conclusion:The method is simple, stable, reproducible, and can be used for the preparation of quality control.Key Words: TongBikang Capsule;Strychnine;Content Determination

2014-04-02

施猛(1976-)，男，碩士，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司工程師，研究方向?yàn)樗幤费邪l(fā)。

任亞東(1978-)，男，碩士，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司執(zhí)業(yè)藥師，研究方向?yàn)樗幤飞a(chǎn)質(zhì)量管理。

R284.1

A

1673-2197(2014)12-0022-03