超聲滅活飲用水中隱孢子蟲研究

胡健龍,冉治霖,李紹峰,張朝升(.廣州大學土木工程學院,廣東 廣州 50006；2.深圳信息職業(yè)技術學院交通與環(huán)境學院,廣東 深圳 5872；3.深圳職業(yè)技術學院,深圳市工業(yè)節(jié)水及城市污水資源化技術重點實驗室,廣東 深圳 58055)

超聲滅活飲用水中隱孢子蟲研究

胡健龍1,3,冉治霖2,3,李紹峰3*,張朝升1(1.廣州大學土木工程學院,廣東 廣州 510006；2.深圳信息職業(yè)技術學院交通與環(huán)境學院,廣東 深圳 518172；3.深圳職業(yè)技術學院,深圳市工業(yè)節(jié)水及城市污水資源化技術重點實驗室,廣東 深圳 518055)

為研究超聲對飲用水中隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)的滅活情況,考察了超聲頻率、功率、pH值和溫度對滅活率的影響,通過形態(tài)學觀察初步探討了超聲滅活隱孢子蟲的機制,并進行了滅活動力學分析.結果表明,低頻有利于隱孢子蟲滅活,19.8kHz, pH7.2,溫度(20±1)℃條件下超聲15min滅活率可達92.5%,頻率升高滅活率反而下降.在本實驗條件下,超聲功率103W對隱孢子蟲的滅活效果與151W的相近,pH值對超聲滅活隱孢子蟲的影響不大,36℃超聲滅活15min滅活率為95.6%,而在9℃下超聲15min滅活率為88.3%,水溫升高有利于滅活.滅活前后的形態(tài)學變化表明超聲空化作用導致細胞膜破壞,細胞質流出從而起到滅活孢囊的效果.超聲滅活隱孢子蟲遵循假一級反應動力學,滅活隱孢子蟲以低頻率高功率的效果最好,可認為隱孢子蟲的滅活以超聲空化的強度為主.

隱孢子蟲；超聲；飲用水；滅活

以隱孢子蟲為代表的致病性微生物感染性極強,可通過食物和水進入人畜體內,引起痙攣、反胃及腹瀉等不良癥狀,是兒童、老人和免疫缺陷者的重要的致病原[1].在未用抗逆轉錄病毒治療的艾滋病患者中感染率可高達100%[2].

隱孢子蟲體外有一層卵囊包裹對傳統(tǒng)的加氯消毒法有極強的免疫性[3].而且研究顯示,消毒后水體中的余氯會生成很多致癌副產物[4],因此不能通過單純的增加氯消毒劑的投量對其進行滅活.近些年研究證實超聲波具有引起細胞溶解以及其他一些損傷細胞的能力,比如細胞膜破壞,DNA降解,細胞器損耗等[5].超聲的空化作用被認為是導致微生物滅活的主要原因,超聲的空化作用會產生瞬時的高溫高壓,并由此產生一系列的物理化學反應[6].超聲技術在微生物滅活領域展示出的高效性以及不產生消毒副產物的優(yōu)勢,被認為是一項新型有效的消毒技術[5].目前國內研究超聲滅活致病性微生物主要是針對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等[7-8],缺乏對隱孢子蟲滅活的研究.而國外超聲滅活隱孢子蟲的研究采用聲場條件單一,僅采用固有的頻率與功率,對外部環(huán)境的影響也未作深入探討[5,9-10].

本研究不僅通過調節(jié)超聲的頻率、功率,且改變pH值、溫度等條件,探究聲場和外部環(huán)境等因素對超聲滅活隱孢子蟲的影響;通過形態(tài)學觀察進行滅活機制探討;開展超聲滅活隱孢子蟲動力學研究,以期為超聲或超聲與其他方法耦合用于水中病原微生物的滅活進行知識積累.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置與實驗方法

實驗所用超聲裝置為中國科學院上海聲學研究所提供(圖1),主要分為超聲發(fā)生裝置與超聲傳感器兩部分.該套設備超聲反應器有4部,對應4個超聲傳感器,其中20kHz、40kHz、60kHz對應一部超聲反應器與一個傳感器、200kHz、400kHz、800kHz各自對應一部超聲反應器與一個傳感器,功率均為(0～150)±2W可調.

圖1 超聲處理裝置示意Fig.1 Experiment apparatus of ultrosonic icradiation1.超聲反應器;2.進水口;3.超聲傳感器;4.反應容器; 5.水浴槽;6.出水口

將50mL蟲樣濃度3×105個/mL置入反應容器中,控制溫度(20±1) ,pH℃ (7±0.2),調節(jié)頻率功率,超聲處理15min,期間每隔1min用1.5mL離心管取樣1mL進行活性檢測.

1.2 實驗材料

隱孢子蟲(Cryptosporidium)為雞源隱孢子蟲卵囊C. baileyi,HauC 株,濃度為 3.0×106個/mL. 4℃保存于 2.5%重鉻酸鉀懸浮溶液中.4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI),購于 Sigma(USA).普匹碘胺(PI), 購于Sigma (USA). Hanks 平衡鹽溶液,購于Sigma (USA).

1.3 分析方法

采用熒光染色法[11-13],所取樣品 4℃、10000r/ min離心5min,用HBSS平衡溶液漂洗3次;棄上清液于160μL,加20μL DAPI、20μL PI使用液,37℃避光溫浴1h.取出樣品再用HBSS平衡溶液漂洗3次,將未染上色的DAPI與PI洗掉.處理后樣品涂片,在熒光顯微鏡下鏡檢,所用熒光顯微鏡為OLYMPUS BX-51 (Japan).

圖2 隱孢子蟲熒光染色照片F(xiàn)ig.2 Picture of oocyst observed by4',6-diamidino-2-phenylindole and Propidium Iodide

DAPI會在450nm紫外激發(fā)光下發(fā)出天藍色熒光,而PI會在630nm綠色激發(fā)光下發(fā)出亮紅色熒光.DAPI能夠透過細胞膜與DNA結合,而 PI無法正常通過細胞膜,只有死亡的細胞才會被 PI染色,因此可聯(lián)合應用DAPI和PI判斷隱孢子蟲的活性[14].圖2為DAPI及PI熒光顯色照片.

滅活率計算公式為:

PI+表示PI顯色,DAPI+表示DAPI顯色.

2 結果與討論

2.1 超聲頻率對滅活的影響

圖3 頻率對隱孢子蟲滅活率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic frequency on inactivation of Cryptosporidium parvum

為考察超聲頻率對滅活隱孢子蟲的影響,實驗在 pH=7.0±0.2,P=151W,溫度(20±1)℃的條件下改變超聲頻率進行.由圖3可以看出,隨時間的延長,不同頻率下的滅活率均先迅速增加最后趨于平穩(wěn),且低頻超聲的滅活效果要優(yōu)于高頻超聲.19.8kHz條件下超聲 15min滅活率可以達到92.5%,在39.6kHz條件下超聲15min的滅活率為90.6%.而在806.3kHz的條件下,15min滅活率僅為 71.3%.這可能是由于在功率一定的情況下,頻率增加會導致空化作用更難發(fā)生[15],而空化作用的強度是超聲滅活隱孢子蟲的主要影響因素.有研究顯示頻率增高會導致聲波膨脹相時間變短,空化泡來不及形成、與此同時聲波的壓縮相時間也同時變短,空化泡無法及時崩潰,從而導致空化作用變弱[16].Ashokkumar等[9]采用20kHz固定頻率超聲處理隱孢子蟲15min滅活率達到90%以上.Oyane等[10]采用超聲頻率 26.6kHz隱孢子蟲卵囊的濃度為 2260個/mL,當流速在 33mL/min時滅活率為 97%.因此低頻超聲下隱孢子蟲滅活率更高,說明低頻更利于滅活隱孢子蟲.

2.2 超聲功率對滅活的影響

圖 4表明超聲頻率 19.8kHz,pH=7.0±0.2,溫度(20±1)℃的條件下,不同功率對超聲滅活隱孢子蟲的影響.從圖中可看出,隨功率的增加隱孢子蟲的滅活率也在逐漸提高.在 151W 的條件下超聲 15min的滅活率為 92.5%,103W 的滅活率為90.2%,說明功率達到103W,對滅活率提高有限.

圖4 超聲功率對隱孢子蟲滅活率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic power on inactivation of Cryptosporidium parvum

而在 21W 的條件下 15min的滅活率僅為60.20%.其原因可能是在頻率一定的情況下,功率增加會導致空化泡運動加劇.同時,空化泡振動周期變長,空化泡半徑減小,空化泡由產生到破滅所需的時間也因此變長[15].因此空化作用增強,隱孢子蟲滅活率上升,說明超聲功率增加,有利于隱孢子蟲的滅活.

2.3 pH值對滅活的影響

調節(jié)超聲頻率 19.8kHz,功率 151W,溫度(20±1)℃,分別在pH值為5.3、6.4、7.2、8.9和9.7的條件下進行反應.由圖5可以看出,不同pH值條件下,超聲滅活隱孢子蟲效果有所區(qū)別.pH值在7.2條件下超聲15min滅活率最高為92.5%.而在pH值為6.4和8.9的條件下滅活率分別為88.2%和 90.3%,略低于中性條件下的滅活率,但總體來說pH的影響不大.

圖5 飲用水pH值對隱孢子蟲滅活率的影響Fig.5 Influence of pH on inactivation of Cryptosporidium parvum

2.4 溫度對滅活的影響

超聲頻率19.8kHz,功率151W,pH為7.2,分別在溫度 9,14,21,27,31,36℃的條件下進行超聲滅活實驗.由圖6可以看出,隨溫度的升高滅活率逐漸增加,36℃超聲滅活15min滅活率為95.6%,而在9℃的條件下超聲15min滅活率為88.3%.最終滅活率相差不大,但是從圖中可以看出溫度對滅活速率還是有影響的,溫度越高滅活速率也相應越高.在36℃下滅活率達到80%以上所需要的時間不到2min,而9℃條件滅活率達到80%以上需要反應 10min.有研究顯示溫度升高會導致產生空化泡的閥域值降低,也就是說會使空化作用更容易發(fā)生[16].

圖6 溫度對隱孢子蟲滅活率的影響Fig.6 Influence of temprature on inactivation of Cryptosporidium parvum

2.5 滅活效果形態(tài)學觀察

從圖7(a)和圖7(b)中可以看出在超聲之前隱孢子蟲具有完整的細胞壁,將細胞核牢牢的包裹于其中,而圖 7(c)中可以清楚的看到在超聲處理15min后細胞壁結構遭到破壞,細胞質流出,有些甚至連細胞核也一起流出只有一層空的細胞壁.超聲的空化作用會產生瞬時的高溫高壓,并伴隨著大量具有氧化性的自由基產生,能夠使微生物的細胞壁、細胞膜被破壞,導致細胞質流出,使細胞轉運系統(tǒng)及酶系統(tǒng)受到破壞[17]. Oyane等[18]等的研究顯示超聲可以破壞酵母菌的細胞膜結構,與本實驗得出超聲破壞隱孢子蟲的細胞結構的結果相似.

圖7 顯微鏡下隱孢子形態(tài)照片F(xiàn)ig.7 Pictures of Cryptosporidium parvum under micro-scope(a)超聲前×400顯微鏡下隱孢子蟲的形態(tài)照片;(b)超聲前×400顯微鏡下隱孢子蟲DIC照片;(c)超聲(19.8kHz,151W,pH 7.2,20±1 ℃)15min 后×400顯微鏡下隱孢子蟲的形態(tài)照片

2.6 動力學分析

超聲滅活隱孢子蟲的效果主要取決于超聲空化的強度,而能夠影響超聲空化強度的主要聲場參數為超聲的頻率與功率.所以本實驗采用嘗試法,對頻率與功率影響滅活的數據做初步的動力學分析.

圖8 不同超聲頻率下動力學曲線Fig.8 Evolution of ultrasonic frequency versus sonication time

圖9 不同功率下動力學曲線Fig.9 Evolution of ultrasonic power versussonication time

圖8和圖9分別是不同頻率與功率下的超聲滅活隱孢子蟲的動力學曲線,從表1和表2可知,超聲滅活隱孢子蟲的反應遵從假一級反應動力學,相關線性度都大于0.97.在功率一定的情況下動力學常數隨著頻率的增加降低,而當頻率一定時動力學常數隨著功率的增加而增高. 超聲功率為151W時反應速率為21W的2.99倍,而頻率為 19.8kHz時反應速率為頻率為 806.3kHz的2.42倍,表明在本研究的實驗條件下,功率與頻率對超聲滅活隱孢子蟲的動力學常數影響相近.

表1 不同超聲頻率下假一級反應動力學常數及其相關線性度Table 1 Pseudo-first order rate constant(kobs) and R2observed for different ultrasonic frequencies

表2 不同超聲功率下假一級反應動力學常數及其相關線性度Table 2 Pseudo-first order rate constant(kobs) and R2observed for different ultrasonic power

3 結論

3.1 頻率和功率對超聲滅活隱孢子蟲有顯著影響. 低頻率有利于超聲對隱孢子蟲的滅活,當反應溫度(20±1)℃,功率151W,pH為7.2時,超聲頻率19.8kHz反應15min滅活率達到92.5%.低頻率有利于超聲對隱孢子蟲的滅活;超聲功率增加隱孢子蟲滅活率也隨著增加.

3.2 pH值對超聲滅活隱孢子蟲的影響不大;溫度對超聲滅活隱孢子蟲的滅活率影響不大,但對滅活速率有顯著的影響,溫度越高滅活速率越快. 3.3 超聲的空化作用產生瞬時的高溫高壓,破壞細胞的形態(tài)導致細胞膜變形,細胞質流出從而起到殺滅細胞的效果.

3.4 超聲滅活隱孢子蟲以低頻率高功率的效果最好,而這兩個因素對應的超聲空化作用也最強,且超聲滅活隱孢子蟲遵循假一級反應動力學,相關線性度都大于 0.97,因此可認為超聲對兩蟲的滅活以超聲空化的強度為主.

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Inactivation of Cryptosporidium parvum in drinking water by ultrasonic irradiation.

HU Jian-long1,3, RAN Zhi-lin2,3,

LI Shao-feng3*, ZHANG Chao-sheng1(1.School of Civil Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China；2.Department of Transportation and Environment, Shenzhen Institute of Information Technology, Shenzhen 518172 China；3.Shenzhen Key Laboratory of Industrial Water Saving and Municipal Sewage Reclamation Technology, Shenzhen Polytechnic Institute, Shenzhen 518055, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：431～436

Ultrasonic on inactivation of Cryptosporidium parvum was studied under different operational parameters, such as ultrasonic frequency, ultrasonic power, pH and temperature. The mechanism of inactivation of Cryptosporidium parvum was preliminary discussed by morphological observation, and inactivating kinetic analysis was also focused. The results indicated that low frequency favored the inactivation of Cryptosporidium parvum, 92.5% of inactivating rate could be achieved under the condition of 19.8kHz ultrasonic (15min), pH 7.2and temperature 20±1℃, while the inactivating rate decreased if the frequency increased. Furthermore, the inactivating rates were almost the same regardless of ultrasonic power was 103W or 151W, and the value of pH had slight effect on inactivating. The inactivating rate was 95.6% using ultrasonic treatment for 15min at 36℃ while 88.3% at 9℃, which indicated higher temperature was conducive to the inactivation of Cryptosporidium parvum. Ultrasonic cavitation caused cell membrane damage and cytoplasm outflow in inactivating Cryptosporidium parvum. Ultrasonic inactivation of Cryptosporidium parvum was in line with pseudo-first-order kinetics, and lower frequency and higher power lead to better ultrasonic cavitation. Therefore, it was suggested that the intensity of ultrasonic cavitation was the main factor for inactivating Cryptosporidium parvum.

Cryptosporidium；ultrasonic；drinking water；inactivation

X703.1

：A

：1000-6923(2014)02-0431-06

胡健龍(1988-),男,湖北荊州人,廣州大學土木工程學院市政工程碩士研究生,主要從事隱孢子蟲與賈第蟲滅活研究.

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