一株苯酚降解菌的分離鑒定及響應面法優(yōu)化其固定化

葛啟隆,岳秀萍,王國英 (太原理工大學環(huán)境科學與工程學院,山西 太原 030024)

一株苯酚降解菌的分離鑒定及響應面法優(yōu)化其固定化

葛啟隆,岳秀萍*,王國英 (太原理工大學環(huán)境科學與工程學院,山西 太原 030024)

從太原市焦化廠廢水活性污泥中分離、篩選出一株苯酚降解細菌,經生理生化反應和16S rRNA鑒定,該菌株為Diaphorobacter屬細菌,命名為 PD-07.代謝機制研究表明,苯酚可誘導該菌合成鄰苯二酚 2,3-加氧酶降解苯酚.為了提高該菌株對苯酚的降解率,以海藻酸鈣為材料,對該菌株進行包埋固定化研究.首先采用Plackett-Burman實驗設計篩選出影響固定化菌株苯酚降解率的關鍵因素,然后采用最陡爬坡實驗逼近最大苯酚降解率響應區(qū)域.最后用Box-Behnken實驗設計及響應面回歸分析,應用二次方程對實驗數(shù)據(jù)進行擬合得,擬合曲線與實驗實測值相關性良好,最佳條件為海藻酸鈉濃度3.83%(m/V)、CaCl20.3mol/L、菌膠比1:26.73、固定化時間2h、搖床轉速180r/min、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH值7.2、液固比4.86:1,在此條件下苯酚降解率可達96.89%.

Diaphorobacter sp.PD-07；Plackett-Burman；海藻酸鈉；固定化細胞；苯酚；生物降解；響應面法

℃

苯酚是煤氣、造紙等工廠排出廢水中主要污染物之一[1],水體中5～25mg/L的濃度即可對魚類的生存構成威脅[2],因此,含酚廢水的治理具有重要意義.目前,降解苯酚的方法主要包括吸附法,電化學法以及生物降解法等[3-5],其中生物降解法因低成本,無污染而被廣泛采納[6].

研究表明,具有降解苯酚能力的微生物主要有假單胞菌(Pseudonomonas.sp)[7]、芽孢桿菌(Bacillus.sp)[8]、酵母菌(Yeast trichosporon)[9]、根瘤菌(Rhizobia)[10]、醋酸鈣不動桿菌(A. calcoaceticus)[11]等,其中,大部分研究主要集中在酵母菌、芽孢桿菌以及假單胞桿菌上,對 Diaphorobacter屬的細菌研究鮮見報道.由于高濃度含酚廢水對活性污泥中微生物生長有一定抑制作用[12],而固定化細胞技術因具有可固定優(yōu)勢菌種,提高污染物降解效率,抗毒性強以及延長細胞壽命等優(yōu)點,在降解含酚廢水方面表現(xiàn)出很大潛力.與傳統(tǒng)活性污泥法相比,固定化細胞具有生物密度大,剩余污泥量小,反應過程易于控制等優(yōu)點[13].

固定化微生物方法多種多樣,其中以海藻酸鈣為載體的包埋法最為普遍[14],該法固定的微生物存活力高,傳質性能好,在反應工程中應用靈活

[15],但其可變影響因素較多[16],因此有必要從諸多影響因素中篩選出最為重要的影響因素,由于單因素實驗不能確定主要因素、次要因素,而Plackett-Burman實驗是基于不完全平衡塊原理的實驗設計,能夠從諸多因素中快速有效地篩選出最重要的因素[17].響應面法是一種優(yōu)化過程的統(tǒng)計學實驗設計方法,其中Box-Behnken實驗設計法比較常用[18].該法對各影響因子及其交互作用進行評價,建立曲面模型,確定最佳水平,與正交設計相比,該法所需實驗組數(shù)相對較少,更能直觀體現(xiàn)因變量最佳值[19].

本研究從焦化廢水活性污泥中分離、篩選得到一株苯酚降解菌,并對該菌株進行鑒定及苯酚代謝途徑分析.依據(jù)影響固定化細胞制備條件(海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度等)和培養(yǎng)條件(pH值、溫度、液固比等)等因素依次進行 Plackett-Burman實驗,最陡爬坡實驗和 Box-Behnken實驗,對影響固定化細胞苯酚降解率的相關因素進行了篩選和優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源 所用篩選菌株的活性污泥采集自太原市某焦化廠廢水生物處理系統(tǒng).

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)[20]:胰蛋白 10,酵母浸出粉 5, NaCl 10, pH 7.2～7.4.

自制選擇培養(yǎng)基(g/L):K2HPO40.5, KH2PO40.5, CaCl20.1,NH4Cl 0.5, MgSO4·7H2O 0.2, MnSO4·H2O 0.01, Fe2(SO4)3·H2O 0.01, NaNO31.0, NaMoO4·2H2O 0.01,苯酚按需要量加入,pH 7.2～7.4.

以上培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20min,固體平板和斜面培養(yǎng)基均在上述培養(yǎng)基中加入 2%的瓊脂粉.

1.2 實驗方法

1.2.1 活性污泥的馴化 在液體培養(yǎng)基中利用苯酚作為唯一碳源進行梯度馴化,同時,在馴化的過程中觀察微生物生長情況,60d后,活性污泥體系基本達到穩(wěn)定.

1.2.2 菌株的分離純化 取馴化后的培養(yǎng)液1mL,將其倍比稀釋至 10-8,將稀釋度為 10-2～10-8的菌液涂布于 LB平板培養(yǎng)基上,在生物培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 72h.根據(jù)菌落形態(tài)(形狀,大小,隆起程度,透明程度,邊緣形狀和菌落顏色的差別)挑取高度分散的單菌落至營養(yǎng)瓊脂斜面上進一步劃線分離,通過鏡檢確定其為純菌后,保存在 4℃的冰箱中備用.

1.2.3 苯酚降解菌株的篩選 將所有純化的菌株分別接種至裝有 LB培養(yǎng)液的三角瓶中,在搖床中連續(xù)活化 2代,并將次級培養(yǎng)物活化至吸光度為1.20左右(以LB培養(yǎng)基做空白,此時微生物處于對數(shù)生長期),接種到選擇培養(yǎng)基中,搖瓶振蕩培養(yǎng),每隔一定時間檢測培養(yǎng)物中苯酚濃度,從中選出苯酚降解率最高的菌株.

1.2.4 菌株的鑒定 參照文獻[21]做該細菌的生理生化鑒定,16S rRNA測序由深圳華大基因研究院完成.

1.2.5 細胞粗酶液的提取 將篩選出的菌株接種到唯一碳源培養(yǎng)液(含100mg/L苯酚)和LB培養(yǎng)基中,30℃,180r/min搖床培養(yǎng),取對數(shù)生長期后期菌液 10mL, 4℃,12000r/min高速離心5min,收集菌體,上清液留取待用,菌體用 pH=7磷酸鹽緩沖液清洗兩次,然后用磷酸鹽緩沖液重懸細胞,置于冰水混合物中,用JY92-IIN型超聲破碎儀破碎細胞,再次離心 20min,收集上清液即為粗酶液[22].

1.2.6 細菌DNA的提取 細菌DNA提取參見文獻[23].

1.2.7 PCR反應 以基因組DNA為模板擴增,鄰苯二酚-2,3加氧酶(C23O)引物為(5′-CCAGC AAACACCTCGTTGCGGTTGCC-3′)和(5′-AG AGGCATGGGGGCGCACCGGTTCGATCA-3′),鄰苯二酚-1,2加氧酶(C12O)引物為(5′-CGCCT TCAAAGTTGATCTGCGTGGT-3′)和(5-GCCA ACGTCGACGTCTGGCA-3′)[24],PCR 反應體系:10×Taq聚合酶緩沖液5μL,MgCl2(25mmol/L) 3.75μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,引物各 1.25(10μmol/L)μL,模板 DNA 1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,加重蒸水至50μL.C23O的PCR程序如下:94℃變性 60s,57℃退火 45s,72℃延伸 60s,30個循環(huán), 72℃最終延伸5min;C12O的PCR程序如下:94℃變性 60s,50℃退火 30s,72℃延伸 45s,30個循環(huán),72℃最終延伸5min.測序結果用BLAST軟件與 Genbank數(shù)據(jù)庫中已收錄的基因序列進行同源性比較.

1.2.8 固定化細胞的制備 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的種子培養(yǎng)液吸入離心管中,4000r/min離心10min,棄去上清液,生理鹽水清洗3次.所得菌體制成4mL菌液與海藻酸鈉混合,將混合物通過針筒滴入 CaCl2溶液中,交聯(lián)沉淀,制成固定化細胞顆粒,攪拌一段時間后,4℃中靜置硬化 24h,再用生理鹽水洗滌備用[25].以上操作均在無菌條件下進行.

1.2.9 優(yōu)化實驗設計 本研究以苯酚降解率為響應目標,采用三步法進行優(yōu)化,首先用Plackett- Burman實驗設計選出對固定化細胞苯酚降解率影響較大的因素,然后用最陡爬坡實驗確定響應面分析的中心點,最后利用響應面法中 Box- Behnken實驗設計對影響固定化細胞苯酚降解率的因素進一步研究,通過實驗數(shù)據(jù)擬合響應面模型,最終確定最佳條件,并進行驗證,實驗數(shù)據(jù)分析借助 Minitab和 Design Expert軟件.

1.3 測定與分析方法

細胞濃度的測定采用可見分光光度法,在600nm波長下測定培養(yǎng)液的吸光度(OD600).細胞干重采用干燥恒重法測量,根據(jù)細胞干重標準曲線將吸光度轉換為細胞干重;取培養(yǎng)液吸入離心管內,控制轉速離心后將上清液棄去,離心管倒置數(shù)分鐘,隨即稱量,濕菌體重量=離心后重量-離心管重量[25];苯酚濃度的測定:4-氨基安替比林直接光度法[27];鄰苯二酚-1,2-加氧酶(C12O)活力測定:以單位時間內反應產物(粘糠酸)在 260nm處吸光度變化表示,鄰苯二酚-2,3加氧酶(C23O)活力測定:以單位時間內反應產物(2-羥基粘糖酸半醛)在 375nm 處吸光度變化表示[28],測定系統(tǒng)總體系9mL,內含0.3mmol/L反應底物8.01mL,磷酸緩沖液(pH=7.0)0.39mL和0.6mL粗酶液,以磷酸緩沖液為參比.定義C12O(或C23O)活力單位(U)為25℃條件下每分鐘反應產生1μmol粘糠酸(或 2-羥基粘糖酸半醛)所需酶量.總蛋白含量用Bradford法測定[29],酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數(shù)計算.

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

根據(jù)上述實驗方法,從焦化廢水活性污泥中分離純化,篩選得到單菌落,應用涂布劃線等純化手段,得到24株苯酚降解細菌,再根據(jù)苯酚降解實驗復篩得到一株苯酚降解能力最高的菌株,其編號為 PD-07,該菌 72h對初始濃度1400mg/L苯酚降解率為80.36%,其形態(tài)及生理生化實驗研究,結果如下:菌落為圓形、表面光滑、不透明、端生鞭毛、短桿狀、無芽孢、無莢膜;革蘭氏染色陰性、氧化酶陽性、吲哚實驗陰性、V-P實驗陰性、明膠液化陰性、淀粉水解陰性、甲基紅陰性、硝酸鹽還原陽性、葡萄糖產酸陰性.

經16S rRNA測序獲得的序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的16S rRNA序列進行同源性比較分析得,該菌株16S rRNA序列(Genbank 中的登 錄 號 為 :KF022039)與 Diaphorobacter nitroreducens具有 99%的同源性,結合該菌株的形態(tài)和生理學特性,初步判斷該菌株為Diaphorobacter屬細菌,命名為 Diaphorobacter sp.PD-07.

2.2 苯酚代謝途徑及酶特性分析

分別采用引物 C12O、C23O 對菌株Diaphorobacter sp.PD-07的DNA進行PCR擴增,結果發(fā)現(xiàn)引物C23O有明顯的擴增產物,而 C12O幾乎沒有得到擴增產物.對擴增的C23O基因測序后采用Blast程序對該序列進行比對,發(fā)現(xiàn)該片段與GeneBank中已登錄的AB266139.1鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的序列相比有 98%的同源性,表明菌株PD-07基因組中還具有鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因.

1)根據(jù)果園環(huán)境特點，設計了果園紅外測溫系統(tǒng)測量果樹的樹冠、果實、枝葉以及果園環(huán)境等溫度，減少了測量儀對測量目標的溫度干擾，降低了成本，利于農業(yè)自動化和精細農業(yè)等相關技術的推廣及應用。

在有氧條件下苯酚被苯酚羥化酶轉化為鄰苯二酚,鄰苯二酚進一步被鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶或鄰苯二酚 2,3-加氧酶催化進行鄰位或間位開環(huán)[30].通過測定菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶液中鄰苯二酚 1,2-加氧酶和鄰苯二酚 2,3-加氧酶的活性,初步判斷該菌株降解苯酚的代謝途徑.菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶活性檢測如表 1所示,在以苯酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)液中,菌體粗酶液中鄰苯二酚 2,3-加氧酶的比活力為0.298U/mg蛋白質,而鄰苯二酚1,2-加氧酶的比活力僅為0.009U/mg蛋白質,因此推斷該菌株降解苯酚以間位開環(huán)降解為主.菌體破碎后上清液中鄰苯二酚 2,3-雙加氧酶的活性遠高于未破碎菌體上清液中酶活性,這表明該酶為胞內酶.以LB培養(yǎng)基(不含苯酚)為基質的兩種上清液酶的活性均未檢測到,說明該菌株鄰苯二酚 2,3-加氧酶是誘導酶.

表1 不同基質中鄰苯二酚加氧酶比活力(U/mg蛋白質)Table 1 Catechol dioxygenase specific activities in different substrates (U/mg protein)

2.3 Plackett-Burman實驗確定影響固定化細胞苯酚降解率的主要因素

采用實驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman實驗設計對影響固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的8個因素進行研究,每組實驗重復3次,實驗設計及結果見表2與表3,應用Minitab軟件分析得模型的P=0.021,說明實驗結果可信.苯酚降解率回歸分析復相關系數(shù)為R2=98.35%,說明回歸分析能夠確切的描述實驗數(shù)據(jù).根據(jù)回歸分析結果,可知海藻酸鈉濃度、菌膠比(菌體濕重與膠液體積之比)以及液固比(培養(yǎng)液體積與固定化小球總體積之比)對苯酚降解率存在顯著影響,其中,液固比P值最小(P=0.003),對固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率影響最顯著,其次是海藻酸鈉濃度(P=0.036),再次為菌膠比(P=0.048).其他 5個因素,CaCl2濃度,固定化時間,搖床轉速,培養(yǎng)溫度,初始pH值P值均大于 0.05,對固定化細胞苯酚降解率沒有顯著影響.由此,篩選出3個影響固定化細胞苯酚降解率的關鍵因素.

表2 Plackett-Burman 實驗設計水平及數(shù)據(jù)分析結果Table 2 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 實驗設計及結果Table 3 Design and result of Plackett-Burman experiment

2.4 最陡爬坡實驗(Steepest ascent design)逼近最佳值區(qū)域

當逼近最佳值區(qū)域時才能建立有效的響應面擬合方程[31],故用最陡爬坡法快速逼近最大苯酚降解率區(qū)域.最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向,實驗設計及結果見表4.

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Experimental design and the results of steepest ascent

2.5 響應面法(Response Surface Methodology)分析及最佳條件的確立

根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理,設計了三因素三水平的響應面分析實驗,實驗設計及結果見表5.應用Design Expert軟件對實驗結果進行二次多項回歸擬合后,編碼方程模型為:

式中:Y為苯酚降解率;A、B、C分別為海藻酸鈉濃度、菌膠比、液固比的編碼值.

圖 1散點為實驗所得苯酚降解率,表明實際值與模型預測值的偏離程度.其中散點為實驗值結果,直線為預測值擬合直線.通過圖1及回歸模型方差分析和系數(shù)檢驗(表6)得到,模型復相關系數(shù) R2=0.9969,表明固定化細胞苯酚降解率實驗值與預測值之間有很好的擬合度.失擬項0.1214,差異不顯著;校正決定系數(shù) R2Adj=0.9928,表明僅有 0.72%的固定化細胞苯酚降解率變異不能由該模型進行解釋.另外,統(tǒng)計學中Cook距離,即Di表明某一條數(shù)據(jù)記錄被排除在外,由此造成的回歸系數(shù)變化有多大,通常認為 Di<1時,該數(shù)據(jù)為合理數(shù)據(jù)[32].由圖2分析也可知,用于診斷各種回歸分析中是否存在異常數(shù)據(jù)的 Di值均分布在小于 1的理想范圍內,不存在對回歸系數(shù)的計算產生明顯影響的數(shù)據(jù),說明二次多項式很好地擬合了實驗數(shù)據(jù),因此該模型可用來對實驗結果進行分析和預測.

表5 Box-Behnken實驗設計及固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的實測值Table 5 Box-Behnken experimental design and measured values of phenol biodegradation rate of immobilized strain Diaphorobacter sp.PD-07in alginate

由表6中實驗結果的F值可檢驗各因素的顯著性,根據(jù)響應面分析三維圖(圖 3～圖 5),可直觀地看出各因素之間的交互作用,各因素對響應值的影響并不是簡單的線性關系,且對響應值的影響存在一極值點.由表6回歸系數(shù)顯著性檢驗可得,海藻酸鈉濃度、菌膠比及液固比這 3個因素對固定化細胞苯酚降解率的影響高度顯著,其中海藻酸鈉濃度、液固比和菌膠比、液固比之間對響應值的兩兩交互影響均非常顯著,海藻酸鈉濃度、菌膠比之間對響應值的交互影響不顯著.在3D響應面圖中表現(xiàn)為圖4、圖5的曲面較陡峭,Z軸的值域較大,而圖3的曲面相對平緩,Z軸值域范圍相對較小.

表6 Box-Behnken 實驗回歸分析結果Table 6 Results of regression analysis of the Box-Behnken design

圖1 回歸模型苯酚降解率預測值與實際值的關系Fig.1 Relationship between predicted value and actual value of regression model

將模型構建的方程進行偏導微分處理,得到最佳理論水平為:A =-0.34,B =-0.26,C =-0.28,即:海藻酸鈉濃度3.83 %(m/v)、菌膠比1:26.73、液固比 4.86:1.此時,固定化細胞苯酚降解率的最大預測值為97.35 %.

圖2 回歸模型的Cook距離分布Fig.2 Distribution of Cook’s distance of regression model

圖3 以苯酚降解率為響應值海藻酸鈉濃度與菌膠比的響應曲面Fig.3 Response surface plotted on Sodium alginate concentration and bacteria-cement ratio

圖4 以苯酚降解率為響應值海藻酸鈉濃度與液固比的響應曲面Fig.4 Response surface plotted on Sodium alginate and liquid-solid ratio

圖5 以苯酚降解率為響應值菌膠比與液固比的響應曲面Fig.5 Response surface plotted on bacteria-cement ratio and liquid-solid ratio

2.6 模型驗證及分析

為了驗證模型預測的準確性和有效性,在預測的最佳條件下進行 3組平行實驗,所得苯酚平均降解率為96.89%,可見回歸方程得到苯酚去除率的理論預測值與其實驗值非常接近,誤差僅為0.46%.固定化細胞與游離態(tài)細胞對比實驗結果如圖6所示,實驗對照組中僅有2.3%的苯酚被去除,這說明苯酚蒸發(fā)及海藻酸鈣凝膠小球(未包埋細菌)吸附作用對實驗影響甚微,可忽略不計.固定化細胞苯酚降解時間比游離態(tài)細胞降解時間略短,這很可能是因為就該菌株而言,與高濃度苯酚對其抑制作用相比,海藻酸鈣凝膠小球對底物的傳質阻礙作用相對較小,這與 Wu 等[33]對固定化菌株 Yarrowia lipolytica W29降解廢水中COD研究結果一致.

圖6 固定化細胞與游離態(tài)細胞對苯酚的降解Fig.6 Phenol degradation by free and immobilized cells of strain Diaphorobacter sp. PD-07

3 結論

3.1 從活性污泥中分離得到一株苯酚降解菌,經生理生化反應及 16S rRNA 測序鑒定為Diaphorobacter屬細菌.該菌株可利用苯酚作為唯一碳源和能源,72h對初始濃度1400mg/L苯酚降解率為 80.36%,命名為 Diaphorobacter sp. PD-07.

3.2 通過測定鄰苯二酚雙加氧酶的活性,初步認為在苯酚的生物降解過程中,由苯酚羥化酶催化轉化為鄰苯二酚,再由鄰苯二酚 2,3-雙加氧酶將其轉化為2-羥基粘糖酸半醛,鄰苯二酚2,3-雙加氧酶是該菌株催化鄰苯二酚開環(huán)的誘導型關鍵酶.

3.3 采用 Plackett-Burman實驗設計篩選出影響海藻酸鈉包埋固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的主要因素,即海藻酸鈉濃度、菌膠比和液固比,其中液固比為影響最大的因素.

3.4 應用響應面優(yōu)化設計法確定固定化苯酚降解菌株的最佳條件為:海藻酸鈉 3.83%(m/v)、CaCl20.3mol/L、菌膠比1:26.73、固定化時間2h、搖床轉速180r/min、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH值7.2、液固比 4.86:1.在此條件下苯酚降解率可達96.89%.

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Isolation and identification of a phenol-degrading strain and optimization for its immobilization using response

surface methodology.

GE Qi-long, YUE Xiu-ping*, WANG Guo-ying (College of Environmental Science and Engineering,

Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：518～525

A phenol-degrading strain was isolated from the activated sludge of a cokes wastewater treatment facility in Taiyuan City. Based on its physiology, biochemical characters and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, the isolated strain named PD-07 was identified as a member of the genus Diaphorobacter. Metabolic pathway research showed that the strain could be induced to synthesize intracellular catechol-2,3-dioxygenase.To improve the phenol degradation rate, a study of embedding immobilized strain was conducted with calcium alginate as material. Firstly, factors playing important roles in the phenol degradation rate of immobilized cell were selected based on Plackett-Burman design. Then the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the phenol degradation rate. Finally, the optimal levels of those main factors were further optimized by using Box-Behnken design and response surface analysis. Quadratic equation was adopted to fit the test data. The fitting curve had a good correlation with the measured values. The optimal conditions were as follows: alginate concentration 3.83%(m/V), calcium chloride concentration 0.3mol/L, bacteria-cement ratio 1:26.73, immobilized time 2h, rotation rate 180r/min, culture temperature 30 , initial pH value 7.2, liquid-solid ratio 4.86:1. Under the optimal conditions mentioned above, the phenol degradation rate reached 96.89%.

Diaphorobacter sp. PD-07；Plackett-Burman；sodium alginate；immobilized cell；phenol；biodegradation；response surface methodology

X172

：A

：1000-6923(2014)02-0518-08

葛啟隆(1988-),男,山西運城人,太原理工大學環(huán)境科學與工程學院碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物及水污染控制研究.

2013-06-10

國家自然科學基金資助項目(51378330);山西省青年科技研究基金(2013021023-3);山西省環(huán)境保護廳環(huán)?？蒲许椖?201205)

* 責任作者, 教授, yuexiuping1990@126.com