足細(xì)胞特異性因子nephrin及腫瘤蛋白-1在腎小球硬化過程中表達(dá)變化

保 莉,田大成,鄭亞莉

(寧夏人民醫(yī)院腎內(nèi)科,銀川 750001)

在腎小球硬化(glomerulosclerosis,GS)進(jìn)展的過程中,足細(xì)胞的減少是反映腎小球損傷程度的預(yù)測及觀測指標(biāo)。足細(xì)胞特異性分子nephrin及腫瘤蛋白-1(Wilms’ tumor-1,WT-1)的表達(dá)變化均會影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致足突融合,足細(xì)胞脫落,進(jìn)而發(fā)生GS[1-4]。

為了系統(tǒng)地觀察足細(xì)胞損傷在GS發(fā)展過程中的重要作用,本研究使用的嘌羅霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)腎炎模型,通過觀察其臨床指標(biāo)、病理形態(tài)及nephrin和WT-1的表達(dá)在GS過程中的改變,探討足細(xì)胞損傷在GS過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠(寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心),體質(zhì)量200～220g,隨機(jī)分為對照組與PAN組,PAN組大鼠尾靜脈注射PAN(15mg/kg,Sigma公司,美國),尿蛋白陽性即為造模成功。對照組同法注射等量生理鹽水。分別于第4,8天和4,14,20周測定大鼠收縮壓、血脂、血肌酐、血漿白蛋白、24h尿蛋白定量等指標(biāo),并于上述時間點處死大鼠,取其腎臟,石蠟包埋,切片。

1.2 過碘酸雪夫染色、腎小球硬化指數(shù)及腎小球面積的測定

切片行常規(guī)過碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色,對每個腎小球進(jìn)行半定量評分(0～4分)[5],標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為正常；0.25分是球囊粘連；0.5分是GS面積占腎小球總面積＜10%；1分表示占10%～25%；2分是占26%～50%；3分是占51%～75%；4分是占76%～100%。腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index,GSI)是每一張切片在光學(xué)顯微鏡40倍下可見的所有腎小球總分的平均值。GSI＝[(1×nl＋2×n2＋3×n3)/每張腎小球總數(shù)]×100%。依照Bertram[6]的方法,PAS染色切片在光鏡下拍照,運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件自動測定腎小球面積(glomerular area,GA)。

1.3 nephrin和WT-1免疫組化染色及表達(dá)的測定

4μm腎組織切片脫蠟至水,檸檬酸鹽抗原修復(fù),過氧化氫室溫孵育,加入兔抗鼠nephrin抗體(1∶100,Abcam公司,美國)及WT-1抗體(1∶100,Santa Cruz公司,美國)孵育(4℃冰箱過夜),PBS沖洗,山羊抗兔IgG室溫孵育,PBS沖洗,按照免疫組化二步法步驟操作(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。實驗中以PBS代替一抗作為陰性對照。腎小球毛細(xì)血管襻外緣觀察到有棕黃色線樣沉積為陽性信號,染色程度評分：0分為陰性,l分為弱陽性(低倍鏡下可疑陽性,高倍鏡下明確陽性),2分為中等陽性(低倍鏡下明確陽性),3分為強(qiáng)陽性(低倍鏡下強(qiáng)陽性)；染色范圍評分：0分指無陽性染區(qū)；1分為1%～25%；2分為26%～50%,3分為5l%～75%,4分為＞75%。將單個腎小球染色程度及范圍的評分相乘得積分值,所有腎小球積分的總和再除以腎小球數(shù)量即為nephrin的積分值。WT-1的評分：腎小球內(nèi)可見深棕褐色細(xì)胞核為WT-1的陽性染色,對每個腎小球進(jìn)行足細(xì)胞的計數(shù),進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗。計量資料以±s 表示,組間比較采用配對樣本t檢驗。GA與GSI的相關(guān)性分析采用二元變量的相關(guān)性分析,并求出相關(guān)系數(shù)r。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAN注射后各項臨床指標(biāo)的改變

PAN注射后4周前表現(xiàn)為腎病綜合征,14和20周表現(xiàn)為慢性腎炎及GS的過程。病變隨著時間進(jìn)展,在14和20周腎小球的損害發(fā)展到廣泛粘連及不同程度的GS或透明樣變性,說明造模成功。

2.2 GA及GSI的關(guān)系

PAN組在4周時GA與對照組比較沒有明顯變化,在14周的時候,PAN組的GA明顯大于對照組,在20周時PAN組的GA與正常對照組比較明顯縮小(表1)。PAN組在上述時間點的GSI[(6.21%±0.45%),(25.34%±7.19%),(30.49%±4.37%)]與對照組比較明顯增高(P＜0.01)。將PAN組GA與GSI之間做二元變量的相關(guān)分析,20周時r＝-0.82,P＝0.006,呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖1)。

表1 PAN組大鼠PAN注射后4,14,20周的GATable 1 The GA at 4,14 and 20 weeks after PAN injection(±s )

表1 PAN組大鼠PAN注射后4,14,20周的GATable 1 The GA at 4,14 and 20 weeks after PAN injection(±s )

GA:glomerular area;PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001

Time Group n GA(μm2)4 weeks PAN 85 395.44±5.55 Control 87 381.31±4.94 14 weeks PAN 102 522.36±13.04**Control 98 469.20±8.16 20 weeks PAN 97 438.59±12.11***Control 101 492.69±58.24

圖1 PAN注射后在不同時間點GA及GSI的相關(guān)趨勢Figure 1 Correlation trend between GA and GSI in different time points after PAN injection

2.3 nephrin的表達(dá)

對照組腎組織中可見nephrin呈淺棕色沿腎小球毛細(xì)血管襻呈均勻、線狀分布；4周時PAN組nephrin的表達(dá)較對照組有所減少,可見染色變淺,分布不均,部分線性消失。14周時,nephrin的表達(dá)進(jìn)一步減少,新月體及硬化粘連的部分無表達(dá),系膜嚴(yán)重增生的區(qū)域nephrin的表達(dá)稀疏雜亂。20周時,nephrin在硬化的部位無表達(dá)(表2,圖2)。

表2 不同時間點nephrin的表達(dá)Table 2 Immunohistochemical semi-quantitative analysis of nephrin expression in different time points(±s )

表2 不同時間點nephrin的表達(dá)Table 2 Immunohistochemical semi-quantitative analysis of nephrin expression in different time points(±s )

PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,***P＜0.001

Time Group n Nephrin expression 4 weeks PAN 93 08.230±0.875***Control 86 10.230±1.256 14 weeks PAN 72 07.580±0.712***Control 81 09.740±1.234 20 weeks PAN 85 06.080±1.342***Control 79 07.880±0.924

圖2 nephrin在不同時間點的表達(dá)Figure 2 Expression of nephrin in different time points(ABC×100)

2.4 WT-1的表達(dá)

PAN組在4周時WT-1在足細(xì)胞核的表達(dá)呈深棕色粗大顆粒,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；14周時表達(dá)較對照組有所減少；20周時減少更加明顯,且染色較弱。足細(xì)胞數(shù)量在PAN腎病模型中隨著時間的延長依次遞減(表3,圖3)。

表3 不同時間點WT-1的表達(dá)與對照組之間的比較Table 3 Expression of WT-1 compared with control group in different time points(±s )

表3 不同時間點WT-1的表達(dá)與對照組之間的比較Table 3 Expression of WT-1 compared with control group in different time points(±s )

WT-1:Wilms’ tumor-1,PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,***P＜0.001

Time Group n WT-1 expression 4 weeks PAN 56 10.110±1.557***Control 61 10.140±2.022 14 weeks PAN 66 6.800±1.887***Control 64 9.020±1.732 20 weeks PAN 109 4.430±1.007***Control 112 7.340±1.216

圖3 WT-1在不同時間點的表達(dá)Figure 3 Expression of WT-1 in different time points(ABC×100)

3 討 論

GS是由多種原因所致的腎小球損傷后出現(xiàn)的共同轉(zhuǎn)歸[7]。足細(xì)胞損傷在GS的過程中起著非常重要的作用。PAN腎炎模型是一個經(jīng)典的足細(xì)胞損害模型[8]。我們的臨床數(shù)據(jù)顯示,在早期表現(xiàn)為腎病綜合征時,GA沒有明顯改變,說明早期PAN誘導(dǎo)的主要是急性期的腎病綜合征,并表示造模成功。此時出現(xiàn)大量蛋白尿,說明已經(jīng)存在腎小球濾過屏障一過性的破壞,雖然尿蛋白定量在4周時降至正常,但nephrin的表達(dá)已經(jīng)有所減少,說明存在早期的足細(xì)胞損傷。nephrin表達(dá)減少所體現(xiàn)的足細(xì)胞的損傷程度并沒有引起足細(xì)胞從腎小球基膜上脫落,所以WT-1的表達(dá)沒有明顯變化,說明雖然存在足細(xì)胞的損傷,但足細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯減少。近年來的一些研究也觀察到了這一點,nephrin是腎小球濾過屏障選擇性功能的關(guān)鍵,在沒有出現(xiàn)明顯腎臟組織學(xué)損害和顯著蛋白尿前,nephrin的表達(dá)已經(jīng)明顯下降[9]。還有研究稱,無論是否有足細(xì)胞的脫落,nephrin的異常都會導(dǎo)致蛋白尿[10]。

在14周時,PAN組24h尿蛋白再次明顯增加,雖然沒有第8天時嚴(yán)重,但此時呈慢性進(jìn)行性加重的過程,而GA明顯較對照組增大。此結(jié)果可能是在病程進(jìn)展中,一方面由于腎小球高灌注、高濾過引起了腎臟的代償性肥大；另一方面,GS過程中,部分腎單位破壞,功能喪失,而另一部分殘存腎單位代償性肥大(腎功能代償期)。此時雖然GA由于代償而相對增大,但是由于腎小球部分球囊粘連,毛細(xì)血管襻硬化,所以GSI增大,GA與GSI之間存在著一定的正相關(guān)關(guān)系,但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異,此時nephrin的表達(dá)較前有所減少,說明足細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加重,同時,WT-1的表達(dá)也明顯減少,說明足細(xì)胞數(shù)量減少,在切片中已經(jīng)觀察到硬化的腎小球數(shù)目增多。大量研究表明,在GS的發(fā)展過程中,單位腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)量的減少發(fā)揮著非常重要的作用。Kim等[11]發(fā)現(xiàn)在給大鼠單次注射PAN后,大鼠腎小球的足細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而丟失足細(xì)胞的部位會進(jìn)一步發(fā)生GS。本研究也進(jìn)一步證實了上述觀點,如能完善電鏡結(jié)果將更能在超微結(jié)構(gòu)方面增加足細(xì)胞損傷的證據(jù)。

PAN模型在20周時表現(xiàn)為慢性腎炎綜合征,在此時GA明顯縮小,GS面積進(jìn)一步增加,呈不同程度纖維化、透明變性,GS特征明顯。并且GA與GSI之間呈負(fù)相關(guān),即GA越小,GS的面積越大、程度越重,GSI越大。說明隨著病程的進(jìn)展,大面積的GS、纖維化及透明樣變、使得GA縮小,腎功能進(jìn)行性地發(fā)展到失代償期,最終進(jìn)入終末期腎病。而此時nephrin在硬化的腎小球幾乎已經(jīng)沒有表達(dá),而WT-1的表達(dá)也呈進(jìn)行性下降的趨勢,足細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,除了影響腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)的完整性,還使腎小球基膜大量裸露,與鮑曼囊粘連,加重GS的程度。有研究者在使用PAN模型研究足細(xì)胞的損傷中發(fā)現(xiàn),PAN注射后表達(dá)在大鼠腎臟腎小球足細(xì)胞足突的NF-кB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)上調(diào),引起足細(xì)胞足突的融合,而NF-κB受體激活劑配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)顯著抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,表明RANKL/RANK之間的互動在PAN模型中的足細(xì)胞損傷發(fā)揮著重要的作用[12,13]。上述研究及本研究均證實了足細(xì)胞的損傷與GS之間的密切聯(lián)系。關(guān)于足細(xì)胞損傷與GS的關(guān)系的發(fā)生機(jī)制尚未明確,還需要進(jìn)一步的探索。

4 小 結(jié)

(1)成功建立PAN模型,模擬了腎病綜合征及GS的改變過程。(2)在慢性腎炎晚期(20周)GSI和GA之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,GS程度越重,GA越小。(3)nephrin及WT-1的表達(dá)在PAN模型中隨著慢性腎臟病的進(jìn)展逐漸減少。因此,足細(xì)胞損害及數(shù)量的減少與GS進(jìn)展的過程有密切的關(guān)系。

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