大圍山森林土壤中高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及鑒定

李 悅，李世俊，薛橋麗，胡永金*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 圖書館，云南 昆明650201）

隨著人口膨脹和全球經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，人類對于能源的需求也呈現(xiàn)逐年增長的趨勢，能源短缺問題日益嚴(yán)重，并且全世界每年產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄纖維素資源沒有得到充分利用，造成極大浪費(fèi)和環(huán)境污染[1-3]，這為開發(fā)和利用纖維素提供了無窮的可再生資源。其次近年來對纖維素降解方面的研究最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法就是生物降解[4]，所以尋找和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種，是開發(fā)利用纖維素資源的前提和關(guān)鍵[5-6]。因此，從環(huán)境中篩選酶活高的野生菌株有著重要的意義[7-8]。

實(shí)驗(yàn)以大圍山原始森林土壤為材料，通過初篩（剛果紅纖維素水解試驗(yàn)和濾紙條分解試驗(yàn)）和復(fù)篩（利用3,5-二硝基水楊酸法測定內(nèi)切纖維素酶活，濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活），篩選出了一株具有較強(qiáng)纖維素酶分解能力的菌株，期望能有效回收利用纖維素廢棄物，提高其附加價(jià)值，以適應(yīng)纖維素酶和纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品：云南省紅河州屏邊苗族自治縣大圍山原始森林腐爛落葉下面土壤。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na，分析純）、3,5-二硝基水楊酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊苷（≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；剛果紅（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；定量濾紙（中速）：杭州富陽特種紙業(yè)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g，去皮，切成小塊，煮沸30 min，紗布過濾，定容至1 L，再加2%葡萄糖，1.5%瓊脂，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5%，NH4NO30.1%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，瓊脂2%，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5%，NH4NO30.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%，pH自然，121 ℃滅菌30 min。培養(yǎng)4 d之后用剛果紅染色進(jìn)行鑒定。

濾紙液體培養(yǎng)基[9]：濾紙2%，酵母膏0.4%，NH4NO30.4%，MgSO4·7H2O 0.02%，KH2PO40.4%，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：CMC-Na l%，蛋白胨0.3%，酵母膏0.02%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.4%，CaC12·2H2O 0.03%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HX121-0054立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SHA-BA恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；7200型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DT5-2型低速臺式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的處理

將從菌源地采樣得來的樣品分別溶于無菌水中，稀釋成一系列不同的稀釋度，取10-3、10-4、10-53種稀釋度，涂布于CMC-Na培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，培養(yǎng)。反復(fù)劃線分離至單個(gè)菌落。

1.3.2 初篩[10-11]

（1）將分離得到的單菌落接種于剛果紅纖維素瓊脂平板上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d后用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，再用蒸餾水清洗，最后用1 mo1/L的NaCl溶液脫色30 min。以透明圈的直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，挑選出該比值較大的菌再進(jìn)行劃線分離，鏡檢確定菌體為單菌落后，接種于保藏培養(yǎng)基上保存。

（2）將濾紙條培養(yǎng)基的液體部分裝入250 mL三角瓶中，每個(gè)100 mL，再加入2張滅過菌的濾紙條（濾紙經(jīng)烘干后稱質(zhì)量），將保存的菌種制成菌懸液，分別接種于濾紙條培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，于第7天采用失重法測定濾紙潰解情況，重復(fù)3次，測定反應(yīng)體系中濾紙失重率，挑選出失重率較高的菌再去進(jìn)行復(fù)篩。失重率計(jì)算公式如下：

式中：x為失重率，%；m為接種前濾紙條干質(zhì)量，g；m1為接種培養(yǎng)后濾紙條干質(zhì)量，g。

1.3.3 復(fù)篩[9，12-13]

通過初篩得到的菌株分別接種到CMC-Na液體種子培養(yǎng)基中于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d獲得均勻的種子，然后按一定比例分別接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)6d后離心獲得粗酶，以3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定羧甲基纖維素酶活（carboxyl methyl cellulose activity，CMCA)，濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA)和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）酶活。

粗酶液制備：將發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。酶活單位采用國際定義方法：以1 mL酶液在1 min內(nèi)分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別加入0、0.2mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL），加入3 mL配制好的DNS試劑混合均勻，在沸水浴中加熱10 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，每管稀釋到15 mL，搖勻。在波長540 nm處測定OD值并記錄結(jié)果，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）羧甲基纖維素酶活力（CMCA）測定：分別向4支管中（1支空白管，3支樣品管），加入用pH值為5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制的CMC-Na溶液2.00 mL，然后加入一定稀釋比例的酶液0.50 mL（空白管不加），混勻。將4支試管置于（50±0.1）℃水浴中反應(yīng)30 min，迅速向各管加入DNS試劑3.0 mL，再于空白管中加入稀釋好的酶液0.5 mL。將4支管同時(shí)放入沸水浴中，加熱10 min取出。冷卻至室溫，定容至15 mL，搖勻，以空白管（對照液）調(diào)零，在波長540 nm條件下測OD值。

（3）濾紙酶活力（FPA）的測定：分別向4支管中（1支空白管，3支樣品管），加入（50±0.5）mg濾紙和pH值為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1.5 mL，然后加入一定稀釋比例的酶液0.50 mL（空白管不加），使管內(nèi)溶液浸沒濾紙，蓋塞。將4支試管同時(shí)置于（50±0.1）℃水浴中反應(yīng)60 min。立即向各管加入DNS試劑3.0 mL。再于空白管中加入稀釋好的酶液0.50 mL。后續(xù)操作同上。

（4）β-葡萄糖苷酶酶活的測定：取0.5 mL適當(dāng)倍數(shù)稀釋的酶液，加入0.5 mL 1.0%的水楊苷溶液，55 ℃保溫20 min后，加入3 mL DNS試劑，充分混合在沸水中煮沸5 min，冷卻后，定容至15 mL，搖勻。在波長540 nm處測OD值，另取一支試管加入滅活的酶液作為對照。

1.3.4 菌株鑒定

（1）形態(tài)學(xué)特征初步鑒定[14-15]

將菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)7 d后觀察菌落的特征，在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，置于顯微鏡下觀察。

（2）分子生物學(xué)鑒定

將目的菌送于華大基因科技公司測序，進(jìn)行18S rRNA基因序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，回歸系數(shù)R2=0.999 7，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 初篩

將樣品處理所得196株單菌落點(diǎn)種于剛果紅纖維素瓊脂平板上進(jìn)行初篩，以培養(yǎng)4 d后透明圈直徑和菌落直徑比值≥2.0作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，滿足條件的菌株有20株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，平板上生長的菌株經(jīng)剛果紅染色后結(jié)果如圖2所示，同時(shí)將這20株菌株接種到濾紙條培養(yǎng)基中，測定濾紙失重率，結(jié)果見表2。

表1 剛果紅平板水解圈篩選結(jié)果Table 1 Screening results of hydrolyzed circle by Congo red plate

圖2 霉菌在剛果紅平板上染色后結(jié)果Fig.2 Result of moulds after dying in Congo red plate

表2 濾紙失重率結(jié)果Table 2 Results of filter paper weight loss ratio

根據(jù)表2結(jié)果，以濾紙失重率＞15%為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出的菌株作為下步復(fù)篩的目的菌株，分別是3-2、5-3、11-1、16-7。

2.3 復(fù)篩

將初篩出來的4株菌制成菌懸液，按2%的接種量接種到CMC-Na液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃，120 r/min的條件下，培養(yǎng)6 d后測定不同的酶組分活力，結(jié)果見表3。

表3 不同菌種產(chǎn)酶能力的比較Table 3 Enzyme production capacity comparison of different strains

由表3可知，經(jīng)酶活測定，菌株16-7的各個(gè)酶活最大。相對另外的3株菌而言，無論是透明圈直徑與菌落直徑比值，濾紙失重率，還是各個(gè)酶活值相較之都有優(yōu)勢，因此選擇16-7號菌作為目的菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察：菌株16-7在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，菌落顏色為灰綠色，菌絲質(zhì)地呈地毯狀（半絨毛狀），背面呈灰色，無滲出液，周邊以白色絮狀擴(kuò)散，呈同心圓狀，菌落形態(tài)見圖3。

（2）顯微鏡觀察：營養(yǎng)菌絲具有橫隔，子實(shí)體為掃帚狀，表面產(chǎn)生許多小梗，小梗上著生成串的球狀或圓形分生孢子，單個(gè)孢子較光滑，見圖4。

依據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡觀察，結(jié)合真菌鑒定手冊：初步鑒定為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，青霉屬（Penicillium）。

圖3 16-7菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain 16-7

圖4 16-7顯微鏡下菌株形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of strain 16-7 under microscope

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定[16]

將測得的有效序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blasten檢索。分析結(jié)果表明，菌株16-7的18S rRNA基因序列與小刺青霉（Penicillium spinulosum）的18S rRNA基因序列同源性高達(dá)99%，初步確定該真菌為小刺青霉。16-7的18S rDNA序列長度為452 bp，全序列如下：

GCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGTCCGCG CGCACC GGAGACACCATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGT CTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACA ACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGC CCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGC TCCGTCCCCCCGGGGACGGGTCCGAAAGGCAGCGG GCGGCACCGAGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCT TTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCC GACAACCAATCATCCTTTTCAGGTTGACCTCGGATC AGGTAGGGATACCGCTGAACTTAAGCATA

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用剛果紅纖維素水解及濾紙條分解初篩，液體產(chǎn)酶復(fù)篩的方法篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株是可行的，將多種方法綜合應(yīng)用可得到更為準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。剛果紅纖維素平板透明圈篩選法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的篩選法，該法除了可用于識別產(chǎn)纖維素酶的菌株外，還可根據(jù)透明圈大小、透明圈出現(xiàn)早晚，粗略估計(jì)每株菌產(chǎn)酶能力，大幅度減少了篩選工作量。同時(shí)考慮濾紙是天然結(jié)晶類纖維素，且濾紙酶活力是纖維素酶組分的重要組成，因此可以通過觀察濾紙培養(yǎng)基中濾紙分解程度進(jìn)行二次初篩。最后對CMC酶活，濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測定，綜合反映了3類酶組分的協(xié)同作用，更加真實(shí)準(zhǔn)確地反映了纖維素酶的活力。本研究對目的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定（18S rRNA基因序列分析）相結(jié)合的方法，能夠快速、準(zhǔn)確地對微生物種屬進(jìn)行鑒定。

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