枸杞酒枸杞酶解條件的研究

湯衛(wèi)華，曹天一，王立暉，殷海松，喬長晟*

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化工系，天津 300350；2.天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

以枸杞（Lycium barbarum）為原料釀造的果酒具有酒精度低、酒質(zhì)溫和爽口、果香味濃和營養(yǎng)價值高等特點，基本保持了枸杞的天然營養(yǎng)成分，富含枸杞多糖、枸杞黃酮、維生素、礦物質(zhì)等多種抗氧化物質(zhì)，具有抗老化、抗疲勞、抗腫瘤等作用，是具有很大開發(fā)潛力的酒種[1-4]。

枸杞中含有約40%～55%（以干質(zhì)量計）的總糖（還原糖占22%～28%，葡聚糖占13%）、纖維素占10%，果膠占2%[5]。盡管枸杞中含有較多的糖，但有很大一部分是以葡聚糖、果膠、纖維素的形式存在，而這些是糖酵母是不能利用的。

本實驗通過添加外源酶（葡聚糖酶、果膠酶和纖維素酶）分解枸杞中的難以被酵母利用的多糖，一方面可以提高枸杞原料的利用率；另一方面枸杞細(xì)胞壁的主要成分為纖維素和葡聚糖，可以增加枸杞細(xì)胞壁的通透性，使枸杞中很多香味物質(zhì)及活性物質(zhì)更好地溶解到酒中，提高枸杞酒的風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏中寧枸杞：市購；酵母菌：天津科技大學(xué)工業(yè)微生物重點實驗室保藏。

果膠酶（5 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）和葡聚糖酶（5 000 U/g）：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；蔗糖、3，5-二硝基水楊酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SS230-A打漿機(jī)：廣東醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平：上海精科天平儀器廠；7890A氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞漿液的制備

將枸杞洗凈，將枸杞與水按固液比為15∶85置于打漿機(jī)中打漿10 min，制備成15%的枸杞漿，備用。

1.3.2 枸杞酒加工工藝流程[6]

操作要點：

分選：選用規(guī)格為220～280 粒/50 g的鮮紅色干枸杞。

配比：將枸杞與水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的枸杞漿，備用。

成分調(diào)整：根據(jù)發(fā)酵時生成酒精度要求調(diào)整糖度。根據(jù)1.7 g/100 mL糖生成1°酒精來補(bǔ)加糖量。

活性干酵母活化：在3%的蔗糖溶液中，加入3%（g∶mL）活性干酵母，40 ℃條件下活化40～45 min，然后直接添加到醪液中去。

酒精發(fā)酵：將調(diào)整好的果漿接入活化好的活性干酵母，在一定溫度下發(fā)酵。

澄清過濾：原酒陳釀后基本澄清，但酒中仍有穩(wěn)定的膠體、蛋白質(zhì)等成分，易形成渾濁和沉淀。為提高酒的穩(wěn)定性，仍需加澄清劑處理，經(jīng)過濾然后裝瓶即得成品。

1.3.3 復(fù)合酶制劑作用溫度和時間的確定

復(fù)合酶制劑在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃條件下作用一段時間后測定還原糖的含量；復(fù)合酶制劑在常溫條件下處理0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后，測定還原糖含量。

1.3.4 果膠酶添加量對枸杞漿液中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100 mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的果膠酶，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量。

1.3.5 纖維素酶添加量對枸杞漿液中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纖維素酶，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量。

1.3.6 葡聚糖酶添加量對枸杞漿液中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100 mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的葡聚糖酶，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量。

1.3.7 復(fù)合酶制劑對枸杞漿的影響

選取果膠酶、纖維素酶、葡聚糖酶3個因素，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平正交試驗，將復(fù)合酶制劑添加至15%的枸杞漿中，作用溫度為30 ℃，作用時間為4 h，測定其還原糖含量，所得結(jié)果用SAS軟件進(jìn)行分析。

1.3.8 氣質(zhì)聯(lián)用分析條件

枸杞酒的主要揮發(fā)成分用氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行測定，并將這些物質(zhì)的香味進(jìn)行歸類[7-8]。

氣相色譜條件：進(jìn)樣方式：固相微萃?。籋P-INNOWAX（30m×250 mm×0.25 μm）色譜柱；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保留2 min；240 ℃保持15 min；載氣：高純氦氣；氦氣流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；氣相定量用乙酸異戊酯作為內(nèi)標(biāo)物。

表1 酶解條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis conditions optimization

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，電離電壓70 eV，掃描方式為全掃描，掃描范圍30～350m/z。

1.3.9 其他檢測方法[9]

還原糖：3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法；可溶性固形物：手持糖度計法；果膠：重量法。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶對枸杞漿中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的果膠酶[10]，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量，結(jié)果見圖1。

圖1 果膠酶添加量對枸杞漿液中果膠含量的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on pectin content in wolfberry juice

由圖1可知，隨著果膠酶添加量增加，還原糖含量也在增加，但果膠酶添加量為0.3%、0.4%、0.5%時差異不明顯。因此選定果膠酶0.2%為最適添加量。

2.2 纖維素酶對枸杞漿中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100 mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纖維素酶，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著纖維素酶添加量增加，枸杞漿中的還原糖含量也在增加，但當(dāng)添加量＞0.3%后，枸杞漿中的還原糖含量只有微量的增加，因此選定纖維素酶0.3%為最適添加量。

2.3 葡聚糖酶對枸杞漿中還原糖含量的影響

取5份15%的枸杞漿100 mL，分別加入枸杞干質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的葡聚糖酶，50 ℃加熱4 h后測定還原糖含量，結(jié)果見圖3。

圖2 纖維素酶添加量對枸杞漿液中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of cellulose addition on reducing sugar content of wolfberry juice

圖3 葡聚糖酶添加量對枸杞漿液中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of dextranase dosage on reducing sugar content of wolfberry juice

由圖3可知，隨著葡聚糖酶添加量增加，枸杞漿中的還原糖含量也在增加，但當(dāng)添加量＞0.2%時，枸杞漿中的還原糖含量只有微量的增加，因此選定葡聚糖酶添加量0.2%為最適添加量。

2.4 復(fù)合酶制劑的作用溫度和時間對枸杞中還原糖含量的影響

取復(fù)合酶制劑（果膠酶/纖維素酶/葡聚糖酶=1∶1∶1）以0.2%的添加量加入至15%枸杞漿中[11-13]，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃作用4 h后測定果膠和還原糖的含量；另一份復(fù)合酶制劑同樣以0.2%的添加量加入15%枸杞漿中，在30 ℃處理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后，測定還原糖含量，結(jié)果如圖4（a）和4（b）所示。

圖4（a）顯示，溫度為20 ℃時，還原糖的含量為49.5 g/L，繼續(xù)增加至30 ℃，還原糖的含量增至54.5 g/L；繼續(xù)提高溫度，還原糖的含量增加不明顯，因此選擇水解溫度為30 ℃。

圖4（b）表明，隨著水解時間的提高，還原糖含量也增加，水解4 h后還原糖含量達(dá)到最大值56.9 g/L，因此選擇復(fù)合酶制劑水解時間為4 h。

圖4 復(fù)合酶制劑水解溫度(a)和水解時間(b)對枸杞漿液中果膠含量的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature (a) and hydrolysis time (b)on pectin content of wolfberry juice

2.5 果膠酶、纖維素酶、葡聚糖酶復(fù)合處理對枸杞漿的影響

復(fù)合酶制劑加入到15%的枸杞漿中，水解溫度為30 ℃，水解時間為4 h，以還原糖含量為考察指標(biāo)，按照1.3.9進(jìn)行正交試驗，結(jié)果及極差分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Result and analysis of orthogonal experiments for enzymolysis conditions optimization

由表2可知果膠酶（A）、纖維素酶（B）及葡聚糖酶（C）對糖化結(jié)果影響順序為C＞B＞A，組合A2B3C2最好，即果膠酶0.2%、纖維素酶0.4%和葡聚糖酶0.2%。在此最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，還原糖含量為85.63 g/L。由表3可知，葡聚糖酶含量對結(jié)果影響顯著，果膠酶及纖維素酶對結(jié)果無顯著影響。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.6 枸杞酒的香氣分析

成熟枸杞果實中的主要香氣成分為藏紅花醛、β-紫羅蘭酮、2-羥基-β-紫羅蘭酮和馬鈴薯螺二烯4種物質(zhì)[14-15]。因此，在氣質(zhì)聯(lián)用檢測中，枸杞酒樣中以上4種物質(zhì)的總含量越高則果香越濃郁，酶解前和酶解后枸杞酒中香氣成分氣質(zhì)聯(lián)用色譜圖見圖5，含量測定結(jié)果見表4。

圖5 酶解前(a)后(b)枸杞酒香氣成分氣質(zhì)聯(lián)用色譜圖Fig.5 GC chromatogram of aroma component of wolfberry juice before (a) and after (b) enzymatic process

表4 酶解前后枸杞漿主要香氣成分分析Table 4 Main aromatic components of wolfberry juice before and after enzymatic process

由表4可知，酶解后主要香氣成分的含量都高于酶解前，酶解后香氣總和為13.46 mg/L，是酶解前的1.04倍，表明復(fù)合酶的處理除了能夠提高枸杞汁中的還原糖的含量外，同時有利于枸杞中香味物質(zhì)的釋放，提高枸杞酒的果香味。

3 結(jié)論

正交試驗確定復(fù)合酶制劑影響順序為葡聚糖酶＞纖維素酶＞果膠酶，復(fù)合酶制劑的最佳組合是葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶添加量分別為0.2%、0.3%和0.2%，在最適溫度30 ℃水解含15%枸杞的枸杞漿4 h，還原糖的含量達(dá)到85.63 g/L，是對照組的3.53倍。同時復(fù)合酶制劑能促進(jìn)枸杞中香味物質(zhì)的釋放，酶解前的主要香味物質(zhì)總和是12.91 mg/L，酶解后主要香味物質(zhì)總和達(dá)到13.46 mg/L，增加1.04倍，使發(fā)酵后的成品酒枸杞的香味更濃郁。

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