氣相色譜法測(cè)定脂肪酶催化反應(yīng)體系中的己酸乙酯

羅少華，熊 澤，邵 偉，郭 軍

（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北宜昌 443001）

己酸乙酯作為濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)，是衡量白酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]，市場(chǎng)需求量很大。目前主要利用酸催化法[2]制備；但化學(xué)法制備的產(chǎn)品質(zhì)量不高，同時(shí)酸催化還會(huì)產(chǎn)生大量廢液，造成環(huán)境污染。相比之下，脂肪酶催化合成己酸乙酯反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品風(fēng)味柔和、香醇自然，具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值[3-5]。

在研究有機(jī)介質(zhì)中脂肪酶催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的轉(zhuǎn)化率[6-8]時(shí)，多采用中和滴定法。在對(duì)比研究各種因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響時(shí)，滴定法操作簡(jiǎn)便，盡管使用濃度極低的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，但是由于己酸為弱酸，分析樣品中己酸含量很少且相差不明顯，導(dǎo)致滴定分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定性不好。張艷等[9-10]用氣相色譜法測(cè)定了己酸乙酯的含量，本研究以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器為基礎(chǔ)，以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)物，參考文獻(xiàn)[11-14]的氣相色譜條件，擬建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷（分析純）、乙酸正戊酯（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；正己酸（分析純）：濟(jì)南興隆化工有限公司；脂肪酶（Novozym 435）：丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-7890F氣相色譜儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；SGD-300氮、氫、空發(fā)生器：北京東方精華苑科技有限公司；BSA224S-CW電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

色譜條件：色譜柱（AT.PEG-20M 30m×0.25mm×0.33μm）：中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，T2000P色譜工作站。程序升溫：起始柱溫55℃，恒溫1min，以10℃/min升溫至70℃，恒溫2min，再以20℃/min升溫至180℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度200℃；采用氫焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、溫度220℃進(jìn)行測(cè)定；分流比：不分流；進(jìn)樣量：1μL。

1.3.2 樣品溶液制備

在50mL碘量瓶中加入20mL正己烷和一定量的己酸和乙醇，混合均勻，再加入適量的脂肪酶Novozym435，在45℃恒溫水浴中振蕩反應(yīng)10h；靜置，上清液為樣品溶液。

1.3.3 溶液的配制

量取0.2mL乙酸正戊酯，置于10mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的內(nèi)標(biāo)溶液。

量取0.2mL己酸乙酯，置于10mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。

量取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液5.00mL和內(nèi)標(biāo)溶液3.00mL，置于10mL容量瓶中，正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.4 色譜分離鑒定

分別取不含己酸乙酯和內(nèi)標(biāo)物的陰性對(duì)照溶液（正己烷溶劑）、內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液，在1.3.1的色譜條件下，1μL進(jìn)樣，以便進(jìn)行色譜鑒別。

1.3.5 校正因子f的測(cè)定

取含標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在1.3.1的色譜條件下，1μL進(jìn)樣，測(cè)定己酸乙酯和乙酸正戊酯峰面積積分值，并計(jì)算積分值的比值和相對(duì)校正因子f；連續(xù)6次進(jìn)樣，考察相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.6 最低檢測(cè)限的測(cè)定

量取1.30mL、1.40mL、1.50mL、1.60mL、1.70mL、1.80mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，置于6個(gè)10mL的容量瓶中，在6個(gè)容量瓶中精密加入內(nèi)標(biāo)溶液各3.00mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。在1.3.1的色譜條件下分別進(jìn)樣1μL，觀察各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品岀峰情況，檢測(cè)最小響應(yīng)值，確定最低檢測(cè)限。

1.3.7 樣品中己酸乙酯含量的測(cè)定和精密度評(píng)價(jià)

量取試樣1.00mL，移入2%的內(nèi)標(biāo)溶液3.00mL，加入正己烷稀釋至10mL。混勻后，按校正因子測(cè)定相同的條件操作，根據(jù)保留時(shí)間確定己酸乙酯峰的位置，根據(jù)己酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出樣品中己酸乙酯的含量。連續(xù)取樣6次，取平均值，考察RSD值。

1.3.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

量取1.00mL樣品溶液3份，置于3個(gè)10mL容量瓶中；按己酸乙酯最低檢測(cè)限含量的1.0、1.1、1.2倍量，量取己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，分別轉(zhuǎn)移到容量瓶中；再加入內(nèi)標(biāo)溶液各3.00mL，用正己烷定容、搖勻。在1.3.1的色譜條件下取1μL進(jìn)樣，測(cè)定并記錄己酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出樣品中己酸乙酯的含量和平均回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離鑒定

色譜分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1～圖6。

圖1 陰性對(duì)照溶液的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of negative control solution

圖2 內(nèi)標(biāo)物溶液的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of internal standard solution

圖3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of standard reference material

圖4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of standard stock solution

圖5 樣品溶液的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of sample solution

圖6 加入內(nèi)標(biāo)物的樣品溶液的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of sample with internal standard substance

圖1顯示溶劑正己烷的流出峰，說明陰性對(duì)照溶液無干擾；圖2顯示內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的相對(duì)保留時(shí)間為3.056min；圖3顯示標(biāo)準(zhǔn)品己酸乙酯的相對(duì)保留時(shí)間為4.482min；圖4顯示混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液極好重現(xiàn)了乙酸正戊酯和己酸乙酯的相對(duì)保留時(shí)間分別為3.058min和4.486min；且乙酸正戊酯、己酸乙酯之間分離度大于2；圖5為樣品溶液的色譜圖；圖6是加入內(nèi)標(biāo)物的樣品溶液的色譜圖，圖5、圖6對(duì)比顯示樣品中含有待測(cè)定的己酸乙酯，不存在內(nèi)標(biāo)物，說明本研究選擇的內(nèi)標(biāo)物合適。

2.2 校正因子f的測(cè)定

校正因子f的測(cè)定結(jié)果，見表1。

表1 校正因子實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 1 Results of calibration factor test

計(jì)算相對(duì)校正因子的平均值為0.983 7，測(cè)定相對(duì)校正因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.59%。相對(duì)校正因子是己酸乙酯與內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的質(zhì)量相等時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的峰面積是己酸乙酯組分峰面積的倍數(shù)，由于己酸乙酯與內(nèi)標(biāo)物是同系物，理化性質(zhì)相近，與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的校正因子值0.983 7相符。相對(duì)校正因子f值只與被測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測(cè)器的類型有關(guān)，而與操作條件無關(guān)，實(shí)驗(yàn)中相對(duì)校正因子測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.59%，說明實(shí)驗(yàn)中相對(duì)校正因子f值的測(cè)定穩(wěn)定性好。

2.3 最低檢測(cè)限的測(cè)定

最低檢測(cè)限的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 最低檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Table 2 Result of the lowest detectable limit determination

表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，色譜峰最低響應(yīng)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為2.774μg/mL，因此，本法分析己酸乙酯的最低檢測(cè)限接近2.774μg/mL。

2.4 樣品中己酸乙酯含量的測(cè)定和精密度實(shí)驗(yàn)

樣品中己酸乙酯含量測(cè)定及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 樣品己酸乙酯含量的測(cè)定Table 3 Determination of ethyl hexanoate in sample

根據(jù)樣品測(cè)定的己酸乙酯峰與乙酸正戊酯的峰面積、添加內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度和己酸乙酯的相對(duì)校正因子，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]，計(jì)算樣品中己酸乙酯含量。分析樣品中己酸乙酯平均含量為71.373 4mg/mL，精密度RSD=0.97%。重復(fù)6次取樣分析，樣品中己酸乙酯含量的RSD=0.97%，說明分析操作的精密度好，穩(wěn)定性高。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 己酸乙酯加標(biāo)回收率Table 4 Standard addition recovery of ethyl hexanoate

按己酸乙酯最低檢測(cè)限含量的1.0、1.1、1.2倍量添加標(biāo)準(zhǔn)己酸乙酯對(duì)照品，樣品加標(biāo)回收率見表4。平均加標(biāo)回收率為97.44%，說明本法測(cè)定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量準(zhǔn)確可行。

3 結(jié)論

在正己烷等有機(jī)溶劑中，固定化脂肪酶催化己酸和乙醇合成己酸乙酯轉(zhuǎn)化率高，是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的途徑。研究催化反應(yīng)體系有機(jī)溶劑的選擇、固定化酶的用量、底物己酸和乙醇的濃度和組成、反應(yīng)溫度及時(shí)間等因素對(duì)酯化過程的影響，優(yōu)化己酸乙酯的合成工藝，需要快速、準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定己酸乙酯含量。建立的毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量，操作簡(jiǎn)便快速、省時(shí)、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，己酸乙酯的最低檢測(cè)限為2.774μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.97%，平均加標(biāo)回收率為97.44%。毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量可更有效地研究酶法合成己酸乙酯相關(guān)課題，也可在該法的工業(yè)化生產(chǎn)中，為己酸乙酯半成品和成品質(zhì)量分析提供借鑒。

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