熒光標記DNA分子量內(nèi)標的設(shè)計與制備

楊翩，王邦義，葉健，梁景青，趙興春

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原，030001；2. 公安部物證鑒定中心，北京，100038）

人類遺傳標記的檢測和分析是法醫(yī)學(xué)個體識別鑒定和親子鑒定的理論基礎(chǔ)。DNA遺傳標記由于具有種屬特異性及不隨年齡、營養(yǎng)狀況或環(huán)境變化而改變等特點[1]，逐漸取代血清學(xué)檢測技術(shù)成為20世紀80年代以來主要的遺傳標記技術(shù)。1997年熒光STR檢驗方法被推出，隨著激光激發(fā)多色熒光檢測儀器的普及，STR熒光復(fù)合擴增毛細管電泳自動檢測方法被法醫(yī)DNA實驗室普遍采用[2]，該方法檢測快速、靈敏度高，易于標準化和建立數(shù)據(jù)庫，已成為主流的檢測技術(shù)。熒光法檢測中每個樣本需加入DNA分子量內(nèi)標，并與同時電泳的等位基因分型標準物進行自動比對，方能得出分型結(jié)果。DNA分子量內(nèi)標是一系列已知片段大小且連續(xù)排列的熒光標記DNA片段，用于建立片段大小與片段到達檢測窗時間的直線回歸方程[3]。本文旨在設(shè)計并制備出一套國產(chǎn)化自主化的分子量內(nèi)標，以降低實驗及檢案成本。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR試劑（2×MasterMix）由公安部物證鑒定中心提供；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1模板的制備pMD18-T Vector連接D12S391的等位基因16割膠回收的DNA片段(Insert），經(jīng)克隆后提取重組質(zhì)粒，用核酸蛋白定量儀Nanodrop 1000（ Thermo）測得質(zhì)粒濃度C（ng/μl）后，在10μl酶切體系（質(zhì)粒1μl、SalⅠ1μl、EcoRⅠ1μl、10×Buffer1μl，ddH2O 6μl）中37℃雙酶切1h，95℃變性10min.根據(jù)質(zhì)粒濃度將10μl酶切產(chǎn)物用TE稀釋至1ng/μl，取1μl 1ng/μl酶切產(chǎn)物補TE至1ml成B液，取1μl B液補TE至1ml成E液，E液即為PCR擴增模板。

1.2.2引物的設(shè)計及測試用primer5.0軟件分析pMD18-T Vector質(zhì)粒的全序列，在其1963bp處至2284bp處，ATGC含量均一，無特殊二級結(jié)構(gòu)。選取該500bp左右區(qū)域，在上游（5'）設(shè)計一條固定引物，在下游設(shè)計合成目的片段的一系列下游引物。將設(shè)計出的上下游引物兩兩組合，對模板進行PCR擴增，挑選出能擴增出目的片段的上下游引物組合。

1.2.3PCR擴增及其產(chǎn)物檢測10μlPCR擴增體系，內(nèi)含2× MasterMix（公安部物證鑒定中心）5μl, 2.5μmol/L上下游引物各2μl，模板1μl. 擴增在9700 型基因擴增儀（Applied Biosystems公司）上進行，熱循環(huán)參數(shù)為: 95℃ 11min; 94℃ 30s，59℃ 2min， 72℃ 1min，29個循環(huán)；60℃60min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1μl擴增產(chǎn)物加9μl的TE稀釋10倍，再取1μl稀釋后的PCR擴增產(chǎn)物與20μl去離子甲酰胺和內(nèi)標混合物混勻后，95℃ 5min變性，-20℃ 5min，用ABI 3130XL 型遺傳分析儀（Applied Biosystems 公司）進行電泳檢測，ABI 3130XL Data Collection Software 3.1收集數(shù)據(jù)，GeneMapper IDV3.3軟件自動分析數(shù)據(jù)。

1.2.4DNA分子量內(nèi)標的制備取65bp、105bp、149bp、200bp、241bp、269bp、311bp、345bp、400bp、450bp、500bp等11個片段PCR產(chǎn)物各1μl，混勻后經(jīng)ABI 3100XL遺傳分析儀檢測，根據(jù)峰高適當調(diào)整不同片段加樣量，使各峰峰高達到均衡。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

圖165bp-500bp11個片段的PCR擴增結(jié)果Figure 1 PCR amplification results of 11 fragments range from 65bp to 500bp

用上述引物設(shè)計方法共設(shè)計出了1條熒光標記的上游引物，24條普通下游引物。用上述10μl擴增體系對各對引物進行測試，最終挑選出11對合適的引物組合，結(jié)果見表1。

2.2 PCR擴增結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物電泳顯示，65bp-500bp的DNA片段均已擴增出（圖1），且片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 DNA分子量內(nèi)標結(jié)果

將65bp-500bp的11個片段的擴增產(chǎn)物混合調(diào)平，調(diào)平加樣量見表2，調(diào)平結(jié)果見圖2，可見出峰位置正確，無明顯雜峰，可用于毛細管電泳檢測。

3 討論

自從20世紀80年代DNA分析技術(shù)面世后，DNA測序儀或遺傳分析儀得到了廣泛應(yīng)用。這類儀器分析DNA分子量時需要一個分子量標準來對樣品進行計算，即分子量內(nèi)標，又叫分子量內(nèi)對照（Internal Lane Standard）[4,5]。與傳統(tǒng)DNA分子量標準物（Marker）[6～8]相比，分子量內(nèi)標屬內(nèi)對照，其攜帶有熒光標記并與待測樣品在同一毛細管中檢測，因此校對結(jié)果更加準確。另外，分子量內(nèi)標所用的電泳介質(zhì)是

毛細管電泳膠，分辨率可達1個bp，比瓊脂糖凝膠分辨率（幾十個bp）提高了幾十倍，因此其精確度也更高[9]。

本實驗選用pMD18-T載體為模板，與高陽等[10]選用pUC18質(zhì)粒為模板相比，其優(yōu)點在于：1. pMD18-T載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的多克隆位點處的Xba I和Sal I識別位點之間插入了EcoR V識別位點，用EcoR V進行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。這樣的處理使得pMD18-T載體連接Insert以及克隆的效率大大提高，從而能夠得到較多量的模板。2. pMD18-T載體作為模板進行PCR之前，首先經(jīng)過雙酶切變?yōu)榫€狀DNA，一方面縮短了模板長度，使PCR更有效的進行，另一方面將模板DNA由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，提高了擴增效率、減少了非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。

本實驗方法操作簡單，經(jīng)濟快速，效率高，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。制備出的DNA分子量內(nèi)標可用于實驗、檢案及數(shù)據(jù)庫建庫等，具有法醫(yī)物證學(xué)實際應(yīng)用價值。

表1引物組合Table1 11 primer combinations

表2PCR擴增產(chǎn)物調(diào)平加樣量Table2The content of 11 PCR products in the prepared DNA internal lane standard

圖2制作的DNA分子量內(nèi)標Figure 2Prepared DNA internal lane standard

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