補(bǔ)腎生精湯對(duì)鉛損傷小鼠生精細(xì)胞凋亡的影響*

田洪艷 李質(zhì)馨徐 冶 王弘珺 林冬靜 潘曉燕 金玉姬 劉忠平 孫 奇吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）

補(bǔ)腎生精湯對(duì)鉛損傷小鼠生精細(xì)胞凋亡的影響*

田洪艷 李質(zhì)馨**徐 冶 王弘珺 林冬靜 潘曉燕 金玉姬 劉忠平 孫 奇吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（吉林 132013）

目的探討補(bǔ)腎生精湯對(duì)鉛損傷小鼠生精細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療重金屬所致男性不育提供理論依據(jù)。方法成年健康清潔級(jí)ICR雄性小鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組10只。醋酸鉛灌胃建立睪丸損傷模型（30mg/kg體質(zhì)量，0.1ml/10g容積），采用中藥補(bǔ)腎生精湯灌胃治療（15.0g/kg，即25mL/kg體質(zhì)量），每天1次，共28d。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察；JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位變化情況，NucleoCounter NC-3000TM對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行分析。結(jié)果TUNEL法檢測(cè)，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量（11.60±2.01）明顯高于對(duì)照組（1.20±1.03）（P＜0.01），陽(yáng)性細(xì)胞多發(fā)生于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的位置；給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)（3.40±1.78）明顯低于模型組（P＜0.01）。JC-1染色法檢測(cè)，模型組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例為（74.20%±1.3038），明顯高于對(duì)照組（31.80%±0.8367）（P＜0.01）；給藥組去極化細(xì)胞比例為（54.20%± 1.3038），低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論 補(bǔ)腎生精湯可通過(guò)抑制生精細(xì)胞凋亡而改善鉛損傷小鼠的生精功能。

補(bǔ)腎生精湯; 鉛; 生精上皮; 細(xì)胞凋亡

隨著全球工業(yè)化的進(jìn)程，環(huán)境中鉛等重金屬對(duì)人類生殖健康的威脅已日趨嚴(yán)重[1]。睪丸是鉛毒作用的靶器官[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，鉛可透過(guò)血-睪屏障在睪丸內(nèi)蓄積，誘發(fā)產(chǎn)生活性氧自由基，使睪丸組織發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用，直接損傷生精細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、質(zhì)量下降、畸形率升高[3]，最終導(dǎo)致男性不育，其修復(fù)及保護(hù)機(jī)制一直是臨床及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。補(bǔ)腎生精湯是以“腎主生殖”為理論基礎(chǔ)，精心篩選、配伍創(chuàng)立的中藥復(fù)方，經(jīng)多年臨床實(shí)踐證明，對(duì)少弱精子癥有顯著療效。本研究采用補(bǔ)腎生精湯對(duì)鉛所致生精功能損傷小鼠進(jìn)行治療，研究其在細(xì)胞凋亡中的作用，為臨床治療重金屬損傷所致男性不育提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性ICR小鼠30只，體質(zhì)量（25 ±2）g，購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK-（吉）2007-0003。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、給藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18℃～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，規(guī)律光照，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

（二）試劑及儀器

醋酸鉛，溫州市化學(xué)用料廠；多聚甲醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，武漢博士德公司。Leica-RM 2245石蠟切片機(jī)，德國(guó)；Olympus-FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡，日本；細(xì)胞篩，南京生物技術(shù)有限公司；TD-SA型離心機(jī)，河南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；NucleoCounter NC-3000TM線粒體膜電位檢測(cè)儀，丹麥。

（三）藥品制備

補(bǔ)腎生精湯配方：人參25g，鹿茸10g，鹿角膠30g，枸杞子50g，海狗腎1對(duì)（約60g），鹿鞭（30g），陽(yáng)起石40g，淫羊藿50g，鎖陽(yáng)30g，熟地40g，菟絲子40g，牛膝30g，當(dāng)歸30g，川芎30g，酒白芍30g，蜈蚣10條（約50g），甘草梢25g。以上藥物購(gòu)自吉林江城大藥房。將補(bǔ)腎生精湯方藥按照傳統(tǒng)方法水煎成劑，濃度為0.6g/mL。將煎藥裝入無(wú)菌消毒的食品容器內(nèi)，室溫冷卻，-20℃儲(chǔ)存。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）模型制備

每日早8:00，根據(jù)文獻(xiàn)資料記載的染毒劑量[4]，模型組以0.4%醋酸鉛灌胃染毒1次（30mg/kg體質(zhì)量，0.1mL/10g容積）；給藥組以0.4%醋酸鉛灌胃（30mg/kg體質(zhì)量，0.1mL/10g容積）；對(duì)照組給予與前兩組等劑量的0.9%生理鹽水灌胃。連續(xù)28d。

（二）治療方法

造模同日下午2:00進(jìn)行。將補(bǔ)腎生精湯置于室溫融化，充分震蕩搖勻。參考臨床成人用量為體質(zhì)量70kg，每日200mL，折合生藥1.68g/kg，每kg體質(zhì)量2.8mL。根據(jù)人與小鼠劑量換算關(guān)系，小鼠用藥劑量為每日1.68g/kg×9.01≈15.0g/kg體質(zhì)量，即每kg體質(zhì)量25mL。給藥組以每日每kg體質(zhì)量15.0g（25mL）灌胃進(jìn)行治療；對(duì)照組和模型組灌胃給予0.9%生理鹽水每kg體質(zhì)量25mL，連續(xù)28d。

（三）標(biāo)本制備

每組取5只小鼠，乙醚麻醉，打開胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定；待小鼠四肢、尾部僵直后，取睪丸；制備石蠟切片，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。每組剩余5只小鼠，脫臼處死，取兩側(cè)睪丸，剪開白膜，用注射器芯剝出生精小管置于100目細(xì)胞篩上（細(xì)胞篩置于盛有1 mL PBS的平皿內(nèi)），其上鋪100目尼龍網(wǎng)，用注射器芯在尼龍網(wǎng)上輕輕研磨，并將研磨物吹入平皿液體內(nèi)；將平皿內(nèi)液體經(jīng)300目細(xì)胞篩過(guò)濾；濾液離心150×g，5min，離心2次，去掉上清液，收集細(xì)胞，加PBS 1mL輕輕吹打，混勻細(xì)胞，細(xì)胞密度約2.5×106，采用NucleoCounter NC-3000TM對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。

（四）生精細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，陰性對(duì)照以PBS代替末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）反應(yīng)液，熒光素標(biāo)記，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察，胞核呈黃綠色為陽(yáng)性。每組隨機(jī)選取30個(gè)視野（×100），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

（五）細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

采用JC-1親脂性陽(yáng)離子染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，NucleoCounter NC-3000TM對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行分析。健康細(xì)胞膜完整，線粒體膜電位高，JC-1染料聚集在膜上，呈現(xiàn)紅色熒光；凋亡細(xì)胞膜通透性增加，線粒體膜電位低，JC-1以單體形式進(jìn)入基質(zhì)中，呈現(xiàn)綠色熒光。利用紅色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度比來(lái)判斷細(xì)胞的線粒體膜電位是否發(fā)生了去極化，是否發(fā)生凋亡。每組5個(gè)樣本，檢測(cè)去極化細(xì)胞比例。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、生精細(xì)胞凋亡檢測(cè)

TUNEL法染色，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，發(fā)出明亮的黃綠色熒光，背景呈淺綠色。對(duì)照組生精細(xì)胞中只見(jiàn)少數(shù)散在分布的凋亡細(xì)胞（凋亡細(xì)胞數(shù)1.20±1.03）（圖1A）；模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量（11.60±2.01）明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），陽(yáng)性細(xì)胞多發(fā)生于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的位置（圖1B）；給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)量（3.40±1.78）明顯低于模型組（P＜0.01）（圖1C）。

二、細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

JC-1染色，Nucleocounter NC-3000TM檢測(cè)分析，健康細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，利用紅色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度比判斷細(xì)胞的線粒體膜電位是否發(fā)生去極化，是否發(fā)生凋亡。圖2所示，模型組（圖2B）去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例為（74.20%±1.3038），明顯高于對(duì)照組（圖2A）（31.80%±0.8367）（P＜0.01）；給藥組（圖2C）去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例為（54.20%±1.3038），低于模型組（P＜0.01）。

圖1 共聚焦激光掃描顯微鏡對(duì)睪丸生精細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

圖2 Nucleocounter NC3000TM對(duì)線粒體膜電位的檢測(cè)

討 論

環(huán)境因素所致生殖障礙和睪丸萎縮的主要原因是生殖細(xì)胞凋亡[5]。鉛等重金屬是較早被認(rèn)識(shí)的凋亡誘導(dǎo)因子之一[6]。具有環(huán)境雌激素樣作用的重金屬通過(guò)雌激素受體等信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡紊亂，精子數(shù)量和質(zhì)量下降，影響生殖功能[7]。環(huán)境鉛污染不僅可致生殖系統(tǒng)損傷，也可造成人體肝、腎等多系統(tǒng)、多臟器的損害[8]。因此，對(duì)生殖系統(tǒng)損傷的治療不能只單一針對(duì)生殖系統(tǒng)，應(yīng)開展全身的系統(tǒng)治療，而中醫(yī)中藥在該方面具有辨證論治、治病求本的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

中藥復(fù)方是祖國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)的重要組成部分，是中醫(yī)扶正祛邪、辨證論治的集中體現(xiàn)，其君臣佐使等配伍的獨(dú)特規(guī)律及療效的優(yōu)越性已為數(shù)千年的臨床實(shí)踐所證實(shí)。本研究采用的補(bǔ)腎生精湯源自于“腎主生殖”理論，該理論是中醫(yī)臟象學(xué)說(shuō)對(duì)人體生殖功能、生理病理的基本認(rèn)識(shí)。腎藏精是腎主生殖的基礎(chǔ)，是腎的重要功能之一，《素問(wèn)·六節(jié)臟象論》指出腎為“封藏之本”，主要就是體現(xiàn)腎的藏精作用。腎藏先天之精即生殖之精，稟受于父母，與人的生育繁殖有關(guān)。腎是先天的根本，接受其他臟腑的精氣而儲(chǔ)藏起來(lái)，五臟的精氣充旺，腎精的生成、儲(chǔ)藏和排泄才能保持正常。大量臨床實(shí)踐表明，補(bǔ)腎中藥能夠通過(guò)補(bǔ)腎生精而調(diào)節(jié)生殖功能[9]。補(bǔ)腎生精湯方藥中，人參、鹿茸補(bǔ)腎益精為君藥；鹿角膠、枸杞子溫補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血，海狗腎、鹿鞭暖腎壯陽(yáng)、益精補(bǔ)髓，陽(yáng)起石、淫羊藿、鎖陽(yáng)溫腎壯陽(yáng)，熟地、菟絲子補(bǔ)精益髓，共為臣藥；牛膝補(bǔ)肝腎、引經(jīng)下行，當(dāng)歸、川芎補(bǔ)血活血、調(diào)眾脈，酒白芍養(yǎng)血柔肝、斂陰收汗，蜈蚣攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛，共為佐藥；甘草通十二經(jīng)、調(diào)和諸藥為使藥。研究顯示，鉛損傷模型組睪丸凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，陽(yáng)性細(xì)胞多發(fā)生于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的位置；給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組。線粒體膜電位分析，模型組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例明顯高于對(duì)照組；給藥組去極化細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例低于模型組。研究結(jié)果提示，補(bǔ)腎生精湯可通過(guò)抑制睪丸細(xì)胞過(guò)度凋亡而拮抗鉛對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷。

綜上所述，補(bǔ)腎生精湯可通過(guò)補(bǔ)腎生精途徑抑制鉛對(duì)生精細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，拮抗鉛對(duì)生殖系統(tǒng)的損害。但是，補(bǔ)腎生精湯在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。總之，深入研究補(bǔ)腎生精湯在細(xì)胞、分子水平上的作用機(jī)制，有助于臨床治療重金屬損傷引起的男性不育，從而為治療男性不育癥提供新思路，同時(shí)也為鉛作業(yè)男性提供有效的防護(hù)措施。

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（2014-01-10收稿）

Effects of Bu Shen Sheng Jing Tang on apoptosis of spermatogenic cells in lead-treated mice*

Tian Hongyan, Li Zhixin**, Xu Ye, Wang Hongjun, Lin Dongjing, Pan Xiaoyan, Jin Yuji, Liu Zhongping, Sun Qi
Department of Histology and Embryology,Jilin Medical College, Jilin 132013,China

Li Zhixin,E-mail:lzx-62@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Bu Shen Sheng Jing Tang on apoptosis of spermatogenic cells in lead-treated mice, and establish the theoretical basis for clinical treatment of male infertility induced by heavy metals .MethodsTotal of 30 adult male ICR mice were randomly divided into three groups such as the control group, the model group and the treated group. Testis-injuried model was made by intragastric administration of lead acetate(30mg?kg-1, 0.1ml?10g-1). Mice in the treated group received intragastric administration of lead acetate and Bu Shen Sheng Jing Tang (15.0g?kg-1, 25mL?kg-1) at the same time for 28days. Mice in the control group received the same amount of 0.9% NaCl by intragastric administration as well. Apoptosis was examined with TUNEL and observed under the confocal laser scanning microscope. Mitochondrial potential was examined with JC-1 and analyzed by NucleoCounter NC-3000TM.ResultsThe number of apoptosis cells(3.40±1.78) in the treated group was lower than that in the model group(11.60±2.01)(P<0.01), moreover the number of apoptosis cells of these two groups were all higher than that of the control group. The rate of depolarization cells(apoptosis cells) (54.20%±1.3038) was lower than that in the model group (74.20%±1.3038) (P<0.01).ConclusionThe results suggest that Bu Shen Sheng Jing Tang supplementation protects the testicular spermatogenisis of lead-treated mice by inhibiting spermatogenic cells apoptosis.

Bu Shen Sheng Jing Tang; lead; seminiferous epithelium; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.004

R321.1

資助: 吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（課題編號(hào)2012485，2012484）
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, E-mail: lzx-62@163.com; Tel: 13894201345