神經性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體內氧化應激狀態(tài)研究*

沈寒堅 朱廣友沈 彥 王飛翔 翁少崢

司法部司法鑒定科學技術研究所, 上海市法醫(yī)學重點實驗室（上海 200063）

神經性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體內氧化應激狀態(tài)研究*

沈寒堅 朱廣友**沈 彥 王飛翔 翁少崢

司法部司法鑒定科學技術研究所, 上海市法醫(yī)學重點實驗室（上海 200063）

目的通過海綿體神經損傷建立神經性勃起功能障礙大鼠，研究其陰莖海綿體組織內氧化應激狀態(tài)，及其對于大鼠陰莖勃起功能的影響。方法取成年雄性SD大鼠60只，隨機分為3組：A組為假手術組（Sham組），B組為單側海綿體神經切斷組，C組為雙側海綿體神經切斷組。各組大鼠造模手術后8周，進行勃起功能試驗后處死，取大鼠陰莖海綿體組織，測定大鼠陰莖海綿體組織中超氧化物歧化酶（SOD）水平、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活力，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，以及NADPH氧化酶gp91phox和p22phox亞基的mRNA表達情況。結果單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織SOD水平、GSH-PX活性低于假手術組。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織MDA含量高于于假手術組。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織NO濃度和eNOS活力均低于假手術組。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織內NADPH氧化酶的gp91phox亞基和p22phox亞基mRNA的相對表達倍數均高于假手術組。結論 通過對大鼠陰莖海綿體組織氧化應激相關指標（SOD、GSH-PX、MDA）、血管內皮功能相關指標（NO、eNOS）以及NADPH氧化酶功能亞基mRNA的相對表達倍數的測定，單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的上述指標與假手術組之間均存在統(tǒng)計學差異，說明大鼠海綿體神經損傷致陰莖勃起功能障礙的過程中，除了本身神經損傷以外，陰莖海綿體組織的氧化應激以及NADPH氧化酶相關的陰莖海綿體血管內皮損傷也是大鼠神經性ED的發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。

勃起功能障礙; 氧化性應激; NADPH氧化酶

神經性陰莖勃起功能障礙（NED）約占ED的10%～19%，主要的相關病變包括急性神經損傷、前列腺癌、糖尿病和帕金森病等，海綿體神經（CN）的損傷最為常見，是最主要的致病因素。盆腔惡性腫瘤術后或者外傷后，ED的發(fā)生率明顯升高，因為在手術及外傷過程中CN可能會被切斷、撕裂或者牽拉等，從而造成其損傷。CN的失用會破壞海綿體的勃起疲軟循環(huán)，進一步引起海綿體平滑肌結構上的損傷，從而發(fā)生繼發(fā)性的勃起功能慢性喪失。CN損傷后導致勃起功能障礙的機制尚未完全闡明，其中細胞活性氧所致的氧化應激反應被認為是最重要的機制之一。本研究通過損傷CN，來構建大鼠NED模型，并對大鼠陰莖海綿體組織內氧化應激狀態(tài)，及其對于大鼠勃起功能的影響進行研究。

材料與方法

一、實驗動物

取成年雄性SD大鼠60只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供），體質量200～300g，實驗大鼠進入研究前交配試驗證實均有正常的性功能，在14 h光照/10 h黑暗周期恒溫環(huán)境下圈養(yǎng),隨意進食,直至試驗的當天。將 60只大鼠分為3組：A組為假手術組（Sham組），即大鼠下腹正中切口后，暴露并游離出盆腔星狀神經節(jié)（MPG）和海綿體神經，不經任何其他處理即縫合關閉腹膜和皮膚；B組為單側海綿體神經切斷組，步驟如第一組，在關腹前用切斷一側海綿體神經，造成一側海綿體神經損傷，之后關閉縫合腹膜和皮膚；C組為雙側海綿體神經切斷組，步驟如第一組，在關腹前用切斷雙側海綿體神經，造成雙側側海綿體神經損傷，之后關閉縫合腹膜和皮膚。大鼠行手術處理后，繼續(xù)上述方法飼養(yǎng)8周。

二、手術方式

所有手術均在無菌操作下完成，以4%水合氯醛（1ml/100g）大鼠腹腔注射麻醉。將已麻醉的大鼠仰臥固定于解剖板上，行下腹正中切口，提起包皮沿陰莖背側正中剪開皮膚，直至恥骨聯(lián)合下方，長約3cm，游離腹側陰莖皮膚近端至睪丸上極,打開腹腔，提出睪丸，暴露背側前列腺，在10倍外科顯微鏡下仔細游離前列腺兩側葉后方，可暴露出盆腔星狀神經節(jié)，沿盆腔星狀神經節(jié)向周圍仔細分離可識別出盆神經、腹下神經這兩支主要的輸入支以及沿尿道側面走行的最大輸出支-海綿體神經。所有神經均經多道生理記錄儀（美國BIOPAC 公司，MP150 型）電刺激，觀察陰莖勃起反應予以確認。依上述分組方法制備動物模型。

三、模型評估

大鼠行手術造模后8周，進行海綿體內注射血管活性藥物試驗進行動物模型評估。取鹽酸罌粟堿注射液（1mL:30mg，東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠），用0.9%生理鹽水稀釋，使之濃度為3g/L，取0.14mL（約含罌粟堿0.4mg），經30G頭皮針注射于海綿體內，誘發(fā)陰莖勃起，觀察30min，重點觀察其陰莖勃起情況并計數，陰莖頭膨脹及遠端陰莖體露出為1次勃起。

四、主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）測試盒由南京建成生物工程研究所提供。高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術公司），PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒（大連TaKaRa寶生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM PCR試劑盒（大連TaKaRa寶生物工程有限公司）。

五、指標測定

（一）陰莖海綿體組織中氧化應激和血管內皮相關指標的測定

各組大鼠進行勃起試驗后處死，取大鼠陰莖海綿體組織，按照試劑盒說明書，制成組織勻漿后備用，進行大鼠陰莖海綿體組織中氧化應激相關指標SOD水平、GSH-PX、MDA和血管內皮功能相關指標NO、eNOS含量的測定。

（二）陰莖海綿體組織中NADPH氧化酶gp91phox和p22phox亞基的mRNA表達的測定

1. 總RNA提取：取各組大鼠陰莖海綿體組織, 生理鹽水沖洗干凈并濾紙吸干后放于電子天平稱質量（150±10）mg，放入盛有液氮的研缽體中研磨成粉末狀，直接加1mL裂解液RL后勻漿, 按高純總RNA快速提取試劑盒提取組織總RNA。取制備好的RNA，加入TE Buffer溶解后，用紫外分光光度計, 進行吸光度的測量，A260/A280為1.8～2.0。

2. 逆轉錄反應（RT）：取總質量500ng的總RNA, 逆轉錄反應體系50μL，按逆轉錄試劑盒說明步驟進行，5×PrimeScriptTMBuffer 10μL，PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅠ2.5μL，Oligo dT Primer（50μmol/L）2.5μL, Random 6mers（100μmol/L）2.5μL, Total RNA（0.5 g/L）15μL，RNase Free dH2O 17.5μL。反應條件為:37℃反應30 min（反轉錄），85℃反應5s（變性）。

3. 聚合酶鏈反應(PCR)：目的基因及內參基因的引物序列: GenBank中查出引物mRNA序列號, primer5軟件設計PCR引物, 以GAPDH為內參，引物序列如下: GAPDH: M17701, sense：5'-GGCACAGT CAAGGCTGAGAATG-3'；antisense：5'-ATGGTGG TGAAGACGCCAGTA-3'； gp91-phox： NM023965, sense： 5'-ACAAGGTTTATGACGATGAGCCTA-3'；antisense：5'-CACTGGCAGCAAGATCAGCA-3'；p22-phox:NM024160, sense：5'-ACCGTCTGCTTGGC CATTG-3'； antisense: 5'-TCAATGGGAGTCCACTGC TCAC-3'。目的基因擴增的條件: 均為50μL反應體系,應用GAPDH mRNA作為參照，變性條件: 95℃預變性5min, 95℃變性5s, 60℃退火20s, 72℃延伸20s, 45個循環(huán)。所有操作均參閱文獻及試劑盒說明書進行。

六、統(tǒng)計方法

應用軟件Graphpad prism 5進行統(tǒng)計分析并輸出圖片，用成組t檢驗對所得數據進行顯著性檢驗。

結 果

一、大鼠陰莖勃起情況

大鼠行手術造模后8周，海綿體內注射罌粟堿，陰莖勃起情況見表1。B組大鼠的陰莖勃起次數及勃起比率明顯小于A組，存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），C組所有大鼠的勃起次數均為0。上述結果說明單側及雙側海綿體神經損傷會影響大鼠的陰莖勃起功能，手術造模成功。

表1 各實驗組大鼠陰莖勃起情況（n=20，±s）

表1 各實驗組大鼠陰莖勃起情況（n=20，±s）

組別 數量 陰莖勃起數量 平均勃起次數 勃起率(%) A組 20 20 2.5±0.89 100 B組 20 10 0.6±0.68 50 C組 20 0 0 0

二、大鼠陰莖海綿體組織氧化應激相關指標

假手術組、單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織SOD水平、GSH-PX活性和MDA含量見表2。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織SOD水平、GSHPX活性低于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織MDA含量均均高于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

表2 各實驗組大鼠陰莖海綿體組織SOD、GSH-PX和MDA結果（n=20，±s）

表2 各實驗組大鼠陰莖海綿體組織SOD、GSH-PX和MDA結果（n=20，±s）

組別 SOD(μU/L) GSH-PX(酶活力單位) MDA(μmol/L) A 77.39±6.60 675.35±75.35 3.85±0.26 B 59.13±6.86 313.68±36.73 7.46±0.58 C 53.39±8.34 273.67±62.10 8.56±0.59

三、大鼠陰莖海綿體組織血管內皮功能相關指標

假手術組、單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織NO濃度和eNOS活力結果見表3。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織NO濃度和eNOS活力均低于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

表3 各實驗組大鼠陰莖海綿體組織NO濃度和eNOS活力結果（n=20，±s）

表3 各實驗組大鼠陰莖海綿體組織NO濃度和eNOS活力結果（n=20，±s）

組別 NO(nmol/mL) eNOS(nmol/min.g) A 380.74±32.42 3.92±0.51 B 285.72±50.95 2.15±0.33 C 134.73±22.91 1.74±0.40

四、NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亞基mRNA表達

根據目的基因的原始定量結果，經過管家基因校正后得到gp91phox和p22phox亞基的相對定量結果見表4。單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織內NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亞基mRNA的相對表達倍數均高于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

表4 NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亞基mRNA的相對表達倍數（n=20，±s）

表4 NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亞基mRNA的相對表達倍數（n=20，±s）

組別 gp91phox亞基mRNA的 p22phox亞基mRNA的相對表達倍數 相對表達倍數A 2.85±0.25 3.01±0.42 B 10.65±1.39 14.24±1.88 C 14.96±2.69 17.87±2.44

討 論

細胞活性氧（ROS）包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、次氯酸（HOCl）等。ROS既是細胞信號傳導和基因調控的重要參與者，又是細胞代謝的有害副產物，能引起脂類、蛋白質和核酸的損傷。ROS中的O2-在ED中發(fā)揮重要作用[1]。正常情況下，細胞能通過自身的保護功能使體內的ROS保持正常水平。當體內的ROS過多時，ROS能影響一氧化氮（NO）的生成和其生物利用度，而NO在陰莖勃起過程中作為主要的神經遞質起著決定性作用，從而導致ED[2]。NO與環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）和蛋白激酶（PKG）組成了NO-cGMP-PKG通路，調控著陰莖的勃起狀況。

體內抗氧化系統(tǒng)主要由酶促反應和非酶促反應兩部分活性物質組成，體內酶促反應抗氧化的酶系SOD、CAT、GSH-PX可使活性氧轉變?yōu)檫^氧化氫，最終轉變?yōu)樗头肿友? 從而發(fā)揮清除氧自由基的作用。SOD及GSH-PX是體內非常重要的氧自由基清除劑,能保護細胞免受損傷, 其活力的高低間接反映了機體清除自由基的能力[3]。自由基損傷的主要病理機制是引起脂質過氧化，MDA是脂質過氧化的代謝產物，其水平可反映機體脂質過氧化損害程度。

本實驗研究發(fā)現, 單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織SOD水平和GSH-PX活性均低于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。而反映機體氧化應激損傷的指標MDA在單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組中均較假手術組顯著增加，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），確證了海綿體神經損傷大鼠的陰莖海綿體組織內氧化應激狀態(tài)的存在。由此可以認為，大鼠神經性ED的發(fā)生、發(fā)展過程除了與神經損傷直接相關外，也可能與氧化應激有關。本項研究的結果對此見解提供了新的、直接的證據。

既往的研究發(fā)現，高血壓、動脈粥樣硬化等血管疾病中, 源于NADPH氧化酶的ROS增加，ROS是調節(jié)血管結構和功能狀態(tài)的重要信號分子, 血管內皮細胞、平滑肌細胞和動脈外膜細胞等均可產生ROS, ROS過多與炎性反應、動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓和腫瘤的發(fā)生密切相關[4,5]。在病理狀態(tài)下，NADPH氧化酶可以催化產生大量ROS，尤其是O2-。O2-與NO結合后形成過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）, O2-與NO反應后消耗了NO，使NO減少，影響NO-cGMPPKG通路，從而進一步影響勃起功能[6]；另外，通過該反應合成的ONOO-對陰莖海綿體平滑肌的舒張作用明顯弱于NO[7]。此外，O2-和ONOO-均可以誘導內皮細胞凋亡，使eNOS合成減少，降低NO的合成，而NO的合成減少是ED發(fā)生的重要病理生理過程，同時ONOO-還能夠抑制SOD的功能，降低抗氧化能力，加重氧化應激，并且NO合成的減少和過度消耗還可以增強血小板和粒細胞粘附于血管壁的內皮細胞，隨后釋放血栓素A2和5-羥色胺，介導血管收縮[1]。

NADPH氧化酶最初在吞噬細胞中發(fā)現，由6種不同的亞基組成，分別為催化亞基gp91phox，調節(jié)亞基p22phox、p47phox、p67phox和p40phox，小G蛋白Rac也參與組成NADPH氧化酶[8]，其中gp91phox和p22phox位于細胞膜上，而p47phox、p67phox、p40phox和Rac位于細胞質中。近年來，在非吞噬細胞中陸續(xù)發(fā)現了多種NADPH氧化酶的同源物，根據gp91phox的同源性形成了NOX家族[8]。NADPH氧化酶可以被內皮素-1、血管緊張素-Ⅱ等多種因子激活[9]，其中p47phox的磷酸化是NADPH氧化酶活化的關鍵環(huán)節(jié)[10]。p47phox多個絲氨酸位點發(fā)生磷酸化改變后，引導p47phox、p67phox和p40phox遷移到細胞膜上，與位于細胞膜上的gp91phox和p22phox結合，介導NADPH氧化酶活化[10]，其中gp91phox是其主要的功能亞單位，p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴，可能用來結合Nox的胞質激活因子，從而發(fā)揮在胞內的調節(jié)作用[11,12]。

本研究的另一個目的，就是了解NADPH氧化酶在大鼠神經性ED氧化應激損傷中的作用。本實驗研究發(fā)現, 單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組的陰莖海綿體組織內NADPH氧化酶的gp91phox和p22phox亞基mRNA的相對表達倍數均較假手術組明顯升高，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），促進了陰莖海綿體內氧化應激反應。同時，檢測到大鼠陰莖海綿體組織內MDA增多。

本實驗顯示單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組大鼠的陰莖海綿體組織NO濃度均低于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01），并且單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組大鼠陰莖海綿體組織中NADPH氧化酶的功能亞基的mRNA表達增多，可以推斷源于NADPH氧化酶產生的活性氧也增多，并與NO反應, 使NO生物利用度下降, 導致陰莖海綿體內皮功能下降。此外, 在本實驗研究結果中，單側海綿體神經損傷組和雙側海綿體神經損傷組大鼠的陰莖海綿體組織eNOS活性均低于假手術組，兩兩比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。由這些結果可以認為，陰莖海綿體內血管內皮細胞在受到勃起神經損傷等危險因子刺激時，NADPH氧化酶的活性增強, 源自NADPH氧化酶的活性氧產生增多，包括超氧陰離子、過氧化亞硝基等產生增加，可改變細胞內的氧化-還原狀態(tài),引起一系列的eNOS脫偶聯(lián)與活性氧產生增多的惡性循環(huán), 最終結果導致NO生物利用度進一步降低[13]，從而影響到陰莖勃起功能。

綜上所述，基于本研究結果, 我們認為在大鼠海綿體神經損傷致陰莖勃起功能障礙的過程中，除了本身神經損傷以外，陰莖海綿體組織的氧化應激以及NADPH氧化酶相關的陰莖海綿體血管內皮損傷也是大鼠神經性ED的發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。

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（2014-04-15收稿）

Oxidative stress status in corpus cavernosum tissue of neurogenic erectile dysfunction rats*

Shen Hanjian, Zhu Guangyou**, Shen Yan, Wang Feixiang, Weng Shaozheng Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Shanghai 200063, China

Zhu Guangyou, E-mail: zhugy@ssfjd.com.cn

ObjectiveTo investigate oxidative stress status in corpus cavernosum tissue of neurogenic erectile dysfunction rats.MethodsTotal of 60 male SD rats were divided them into three groupsincluding Group A (sham operated group); Group B(ratswith one side of Cavernous nerve transection; Group C( rats both sides of Cavernous nerve transection). At the 8th weeks after surgery, rats received erectile function test and then were executed. Corpus cavernosum tissues of rats were collected. The levels of Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA), Nitric Oxide (NO), vitality of Glutathione Peroxidase (GSH-PX) and Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), and expression of NADPH oxidasesubunits gp91phox and p22phox in corpus cavernosum tisues were measured.ResultsSOD level and vitality of GSH-PX in Group B and C were lower, than those in Group Awhereas level of MDA was higher. Also, the level of NO and vitality of eNOS in Group B and C were lower than those in Group A, but expressions of NADPH oxidase subunits gp91phox and p22phox were increased as compared with those of shamed operated group.ConclusionTheses results suggest that apart from nerve injury, oxidative stress of corpus cavernosum tissue and NADPH oxidase related Corpus cavernosum endothelial damage may also be major triggers for neurogenic erectile dysfunction of rats.

neurogenic erectile dysfunction; oxidative stress; NADPH oxidase

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.004

R 698.1

資助: 本課題獲司法部司法鑒定科學技術研究所所級基金資助（編號：2010-1）
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, E-mail: zhugy@ssfjd.com.cn