鋅對辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化ERK表達和熱痛閾的影響

王月靜，劉曉露，李富興，韓言秀，張 莉

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

鋅對辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化ERK表達和熱痛閾的影響

王月靜，劉曉露，李富興，韓言秀，張 莉

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

目的研究鋅對辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化(p)的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulate kinase，ERK)表達和熱痛閾的影響。方法72只C57/BL6小鼠隨機分為4組，采用足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制備神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)動物模型：對照組(Con)鋅飼料30 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后足底注射溶劑(吐溫80、酒精和0.9%氯化鈉注射液混合液)；N-NPP組鋅飼料30 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后給予足底注射辣椒素，L-NPP組鋅飼料0.85 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素，H-NPP組硫酸鋅水溶液227 mg/(L·d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素。應(yīng)用動物行為學(xué)檢測、免疫組織化學(xué)、免疫印跡和圖像分析技術(shù)檢測注射后7 d鋅對動物行為學(xué)以及脊髓pERK表達的影響。結(jié)果高鋅喂養(yǎng)能顯著降低脊髓pERK的表達，降低痛敏，使熱痛閾增高(P＜0.01)；而低鋅喂養(yǎng)能增加脊髓pERK的表達，增加痛敏，使熱痛閾降低(P＜0.01)。結(jié)論鋅能抑制辣椒素致痛模型小鼠脊髓pERK的表達和熱痛覺過敏。

鋅；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓；磷酸化；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathy pain，NPP)是由于軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病引起的慢性疼痛。NPP患者的主要臨床特征表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺缺失、痛覺過敏和觸誘發(fā)痛等，給患者帶來極大的痛苦，嚴重影響其生活質(zhì)量[1-2]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulating kinase，ERK)激活是NPP的重要發(fā)病機制之一，在眾多疼痛模型中均發(fā)現(xiàn)ERK磷酸化水平上調(diào)，因此其也經(jīng)常作為檢測痛敏的一個重要指標[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅與NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)密切相關(guān)，但其具體機制尚不清楚[5-6]。本研究利用動物行為學(xué)檢測、免疫組化、免疫印跡和圖像分析技術(shù)，觀察鋅對辣椒素致痛模型脊髓pERK表達以及動物行為學(xué)的影響，為進一步揭示鋅影響NPP的機制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

材料和方法

1 動物分組與模型制備 72只C57/BL6小鼠隨機分4組：采用左后足足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制備NPP模型。1)對照組：正常動物足底注射溶劑(吐溫80、乙醇和0.9%氯化鈉注射液混合液)；2)N-NPP組：適鋅飼料[鋅：30.0 mg/(kg·d)]喂養(yǎng)2周后注射辣椒素；3)L-NPP組：低鋅喂養(yǎng)[鋅：0.85 mg/ (kg·d)]2周后注射辣椒素；4)H-NPP組：高鋅喂養(yǎng)[飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/(L·d)]2周后注射辣椒素。

2 主要試劑與儀器 兔抗小鼠多克隆pERK抗體和山羊抗兔IgG多克隆抗體購自Cell Signaling公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑購自福州邁新公司；GAPDH鼠單克隆抗體購自康成生物公司；辣椒素、ECL試劑盒和膠片購自Santa公司；PVDF膜和蛋白Marker購自NEB公司；光學(xué)顯微鏡和計算機圖像分析系統(tǒng)等。

3 取材與標本制備 足底注射辣椒素后第7天，將各組小鼠經(jīng)4%硫噴妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉后，取腰5節(jié)段脊髓，一部分稱重后，-80℃保存，用于免疫印跡檢測；一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備5 μm厚的石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

4 免疫組織化學(xué)染色檢測pERK在脊髓的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)。3% H2O2孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；正常非免疫動物血清孵育10 min；兔抗小鼠多克隆pERK抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；PBS沖洗，5 min×3次；山羊抗兔IgG(1∶200)室溫下孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色5 min，常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下觀察。用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照。

5 免疫印跡技術(shù)檢測pERK在脊髓的表達 脊髓組織稱重后剪碎，加入裂解液，進行超聲波粉碎，4℃過夜，低溫離心取上清液。測蛋白濃度，沸水浴煮5 min，離心備用。制備分離膠，加樣，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，染膜，封閉，加一抗：兔抗小鼠多克隆pERK抗體(1∶500) 4℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min×3次，加二抗(山羊抗兔IgG，1∶5 000)孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影，計算機圖像分析。

6 動物行為學(xué)觀察 從注射辣椒素前2 d開始，每天觀察小鼠的行為學(xué)變化，觀察有無跛行、注射側(cè)后足不敢著地負重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、離地時間延長等現(xiàn)象，一直觀察到注射辣椒素后第7天。

7 熱痛覺過敏實驗 將小鼠放在一塊透明的玻璃板上，四周用透明的玻璃封閉，等小鼠對周圍的環(huán)境適應(yīng)之后再進行檢測。在玻璃板的底部，將光源照射在小鼠注射辣椒素側(cè)的后足足底所接觸的玻璃板上，記錄從照射開始到小鼠出現(xiàn)抬足或甩足的時間，每只小鼠觀察3次，每次間隔5 min，計算平均值作為熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，即熱痛閾[7]。記錄注射辣椒素前2 d和注射后第7天的痛閾。

8 圖像分析pERK在脊髓的表達 用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化和免疫印跡結(jié)果進行圖像分析。每個樣本選取5張切片，每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機選取3個視野進行檢測，計算平均光密度值(average optical，AO)。

9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用表示，采用單因素方差分析(ANOVA)方法進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠行為學(xué)變化 足底注射辣椒素后第1天即表現(xiàn)出傷側(cè)腳趾外翻并攏，走路費力甚至出現(xiàn)跛行，患肢不能抬起也不敢著地，最常見的狀態(tài)是患足懸空而立并縮至腹部，有時還會出現(xiàn)舔舐患肢及甩足的情況，小鼠明顯不如注射之前活躍，此種行為持續(xù)到檢測期末。其中，低鋅喂養(yǎng)(L-NPP)組小鼠跛行、舔足、甩足和不敢負重等現(xiàn)象最為嚴重，而高鋅喂養(yǎng)(H-NPP)組小鼠的行為學(xué)改變最輕。熱痛閾檢測顯示：與注射辣椒素前相比，各組動物注射辣椒素后7 d的痛敏增強，熱刺激縮足反射潛伏期均顯著降低。其中，L-NPP組最低，H-NPP組最高(P＜0.01)。見圖1。

圖 1 各-組小鼠注射辣椒素前后熱刺激縮足反射潛伏期比較(n=24, x±s, s)(a P＜0.01，與注射前比較；b P＜0.01，各組間比較)Fig. 1 Com par-ison of therm al withdraw al latency in each group (n=24, x±s, s)(a P＜0.01, vs before injection; b P＜0.01 vs each group)

2 pERK免疫組化陽性表達比較 pERK免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，主要表達在脊髓神經(jīng)元的細胞核上。對照組動物在脊髓后角淺層有少量的陽性表達產(chǎn)物，陽性細胞較少。與對照組相比，其他3組NPP動物的pERK陽性表達均增多，陽性細胞密集，平均光密度值增高(P＜0.01)。其中，L-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最密集，AO值最高；H-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最稀疏，AO值最低(P＜0.01)。見圖2、圖3。

3 pERK免疫印跡比較 免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，各組動物都顯示有pERK蛋白的條帶。與對照組相比，其他3組NPP動物的pERK蛋白陽性表達均增多。其中，L-NPP組的表達最多，H-NPP組的表達最低。見圖4、圖5。

圖 2 pERK在各組動物脊髓的表達(免疫組織化學(xué))(×400) A： 對照組； B： 正常喂養(yǎng)的NPP組； C： 低鋅喂養(yǎng)的NPP組；D： 高鋅喂養(yǎng)的NPP組Fig. 2 Immunohistochem istry show ing expression of pERK in spinal cord of control group (A), N-NPP group (B)，L-NPP group (C), and H-NPP group (D) (×400)

圖 3 各組小鼠脊髓p ERK表達的平均光密度(n=24， )(a P＜0.01，各組間比較)Fig. 3 Average optical of pERK expression in model m ice spinal cord of each group (n=24，?)(a P＜0.01, vs each other group)

圖 4 免疫印跡檢測pERK在各組模型動物脊髓的表達Fig. 4 Immune blotting showing expressions of p ERK in spinal cord in different groups

圖 5 各組小鼠脊髓pERK表達的免疫印跡圖像分析結(jié)果(n=24，)(a P＜0.01，各組間比較)Fig. 5 Imm une blotting show ing expressions of p ERK in sp inal cord in different groups (n=24，)(a P＜0.01, vs each other group)

討 論

胞外信號調(diào)節(jié)激酶是絲裂原活化蛋白激酶家族的主要成員之一，它能參與多種神經(jīng)可塑性變化，如長時程增強以及疼痛的產(chǎn)生與維持等[8-9]。近年來，許多痛覺方面的研究結(jié)果表明，ERK可被多種生理或病理因素激活，能夠介導(dǎo)多種胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，在NPP發(fā)生時，其磷酸化(激活)水平增高，與傷害性刺激的傳遞及神經(jīng)敏感化有關(guān)[10-11]。利用ERK的阻斷劑可以有效抑制ERK在脊髓的活化，降低NPP動物的痛覺過敏、痛覺超敏和異位痛等現(xiàn)象，提示ERK激活在NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要的作用[12-13]。本研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果相符，在注射辣椒素后，動物脊髓后角中的pERK表達上調(diào)，動物出現(xiàn)痛覺過敏，熱痛閾值降低，提示，ERK磷酸化水平上調(diào)是神經(jīng)病理性疼痛的一個重要發(fā)病機制，同時也是痛覺過敏的重要標志之一。

鋅離子是生命體的關(guān)鍵元素，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，這些鋅離子主要分布在神經(jīng)元的細胞質(zhì)以及細胞器的小囊泡內(nèi)，參與神經(jīng)傳遞[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓后角的神經(jīng)元中有大量的鋅離子以及其運載體—金屬硫蛋白-Ⅲ，而脊髓后角是包括痛覺等感覺在內(nèi)的初級傳入神經(jīng)元的投射部位[5-17]。Jo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)受損時，動物脊髓后角淺層的鋅離子含量顯著降低，動物出現(xiàn)了痛覺過敏現(xiàn)象，機械痛閾顯著降低，提示鋅離子與痛覺的發(fā)生與傳導(dǎo)密切相關(guān)。在本研究中，我們利用鋅預(yù)處理模型動物，注射辣椒素后，對動物行為學(xué)改變及熱痛閾值進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射辣椒素后，動物出現(xiàn)舔足、甩足等痛敏現(xiàn)象，熱痛閾值降低。高鋅預(yù)處理時，縮足等動物行為學(xué)改變明顯改善，熱痛閾值增加。而低鋅預(yù)處理使動物舔足等行為學(xué)改變加重，熱痛閾值降低。提示鋅能抑制神經(jīng)病理性疼痛的痛覺過敏。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鋅預(yù)處理能降低病理性疼痛模型動物脊髓pERK的表達；而低鋅預(yù)處理的結(jié)果正好相反，增加病理性疼痛模型動物脊髓pERK的表達。提示鋅可能是通過抑制pERK在模型動物脊髓后角的表達，從而對神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生了抑制作用。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果證實了鋅可能是通過抑制ERK在脊髓后角的活化，從而降低了中樞的興奮性和痛覺過敏，因此抑制了病理性疼痛的產(chǎn)生與傳遞。但是，鋅抑制ERK活化的確切機制目前還不十分清楚，需要我們深入地探討與研究。

1 Clark AK， Old EA， Malcangio M. Neuropathic pain and cytokines：current perspectives［J］. J Pain Res， 2013， 6： 803-814.

2 Jeong NY， Shin YH， Jung J. Neuropathic pain in hereditary peripheral neuropathy［J］. J Exerc Rehabil， 2013， 9（4）： 397-399.

3 Kang Y， Zhao Y， Guo R，et al. Activation of ERK signaling in rostral ventromedial medulla is dependent on afferent input from dorsal column pathway and contributes to acetic acid-induced visceral nociception［J］. Neurochem Int， 2013， 63（5）： 389-396.

4 Wang H， Li Y， Dun L，et al. Antinociceptive effects of oxymatrine from Sophora flavescens， through regulation of NR2B-containing NMDA receptor-ERK/CREB signaling in a mice model of neuropathic pain［J］. Phytomedicine， 2013， 20（11）： 1039-1045.

5 Wang Y， Mei X， Zhang L，et al. The correlation among the dynamic change of Zn2+， ZnT-1， and brain-derived neurotrophic factor after acute spinal cord injury in rats［J］. Biol Trace Elem Res， 2011，143（1）： 351-358.

6 張莉，劉明，王月靜．鋅影響坐骨神經(jīng)損傷模型小鼠脊髓P物質(zhì)表達的實驗研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（8）：876-879．

7 劉永峰，楊承祥．坐骨神經(jīng)周圍注射可樂定對CCI大鼠痛域的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2008，29（12）：1960-1962．

8 Shi XD， Fu D， Xu JM，et al. Activation of spinal ERK1/2 contributes to mechanical allodynia in a rat model of postoperative pain［J］. Mol Med Rep， 2013， 7（5）： 1661-1665.

9 Choi DC， Lee JY， Lim EJ，et al. Inhibition of ROS-induced p38MAPK and ERK activation in microglia by acupuncture relieves neuropathic pain after spinal cord injury in rats［J］. Exp Neurol，2012， 236（2）： 268-282.

10 Han M， Huang RY， Du YM，et al. Early intervention of ERK activation in the spinal cord can block initiation of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain in rats［J］. Sheng Li Xue Bao，2011， 63（2）： 106-114.

11 Calvo M， Zhu N， Grist J，et al. Following nerve injury neuregulin-1 drives microglial proliferation and neuropathic pain via the MEK/ERK pathway［J］. Glia， 2011， 59（4）： 554-568.

12 Matsuoka Y， Yang J. Selective inhibition of extracellular signalregulated kinases 1/2 blocks nerve growth factor to brain-derived neurotrophic factor signaling and suppresses the development of and reverses already established pain behavior in rats［J］. Neuroscience， 2012， 206： 224-236.

13 Cho IH， Lee MJ， Jang M，et al. Minocycline markedly reduces acute visceral nociception via inhibiting neuronal ERK phosphorylation［J］. Mol Pain， 2012， 8（1）： 13.

14 Zhang L， Chi ZH， Ren H，et al. Imunoreactivity of Zinc transporter 7（ZNT7） in mouse dorsal root ganglia［J］. Brain Res Bull， 2007， 74（4）： 278-283.

15 Yang Y， Jing XP， Zhang SP，et al. High dose Zinc supplementation induces hippocampal Zinc deficiency and memory impairment with inhibition of BDNF signaling［J］. PLoS One， 2013， 8（1）：e55384.

16 Morris DR， Levenson CW. Zinc regulation of transcriptional activity during retinoic acid-induced neuronal differentiation［J］. J Nutr Biochem， 2013， 24（11）： 1940-1944.

17 張莉，王月靜．鋅對神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠脊髓磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白表達的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（11）：1174-1177．

18 Jo SM， Danscher G， Schr?der HD，et al. Depletion of vesicular Zinc in dorsal Horn of spinal cord causes increased neuropathic pain in mice［J］. Biometals， 2008， 21（2）： 151-158.

Effect of zinc on the phosphorylative ERK expression in capsaicin induced neuropathic pain in mice spinal cord and hot pain threshold

WANG Yue-jing, LIU Xiao-lu, LI Fu-xing, HAN Yan-xiu, ZHANG Li
Department of Histology and Embryology, Liaoning M edical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Corresponding author: ZHANG Li． Email: ln_zhangli@126．com; LIU X iao-lu． Email: 347863939@qq．com

ObjectiveTo observe the effect of zinc on the expression of phosphorylative extracellularsignal-regulate kinase (pERK) in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced neuropathic pain (NPP) in model rats．MethodsSeventy two C57/ BL6 rats w ere randomly divided into 4 groups and capsaicin (0．5%, 5 μl) w as injected in feet of NPP rats to build the model．Control group: normal (zinc, 30 mg/(kg·d)) fed rats injected with solvent (Tween 80, alcohol and 0．9% sodium chloride solution); N-NPP group: normal fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; L-NPP group: low-zinc (0．85 mg/(kg·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; H-NPP group: high-zinc (227mg/(L·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks．Animal ethology observation, immunohistochem istry, immune blotting and image analysis w ere used to test the effect of zinc on the expression of pERK in model m ice spinal cord and the hot pain threshold during seven days after injection．ResultsHigh-zinc feed could down-regulate the pERK expression, im prove the hot pain threshold (P＜0．01), while low-zinc feed can up-regulate the pERK expression, reduce the hot pain threshold (P＜0．01)．ConclusionZinc can inhibit the pERK expression in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced NPP in model rats．

zinc; neuropathic pain; spinal cord; phosphorylation; extracellular signal-regulate kinase

R 741.02

A

2095-5227(2014)08-0863-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.024

2014-01-23

國家自然科學(xué)基金項目(81171799)；遼寧省科技廳資助項目(20111118)；遼寧醫(yī)學(xué)院奧鴻大學(xué)生創(chuàng)新基金(2011D17)；遼寧醫(yī)學(xué)院橫向課題(LYHX2013025)；遼寧醫(yī)學(xué)院奧鴻博澤研究生科研創(chuàng)新基金(2012009)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201210160007) Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171799); Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(2011 1118)

王月靜，女，在讀碩士。研究方向：鋅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Email: 335187646@qq.com；共同第一作者：劉曉露，女，本科在讀。研究方向：鋅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Email: 347863939@qq.com

張莉，女，博士，教授。Email: ln_zhangli@126.com