硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球處理去細胞同種異體神經移植修復大鼠坐骨神經

于光明，王 偉，張 力，張德龍

1遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121001；2錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121013

硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球處理去細胞同種異體神經移植修復大鼠坐骨神經

于光明1，王 偉2，張 力2，張德龍1

1遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121001；2錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121013

目的探討硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學法去細胞同種異體神經移植修復大鼠坐骨神經的可行性。方法用復乳法制備硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球。取成年雄性SD大鼠40只，隨機分為4組(n=10)：硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學法去細胞同種異體神經移植組(A組)、自體神經移植組(B組)、改良化學法去細胞同種異體神經浸泡ChABC神經移植對照組(C組)、改良化學法去細胞同種異體神經移植09%氯化鈉注射液對照組(D組)。取A、C、D 3組動物人工切取右側坐骨神經10 mm，用改良化學法制備移植神經段：A、C兩組浸泡在PBS液中，D組浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH 7.4)中。A組動物取C組制備神經行同種異體神經移植，外膜無張力縫合，并在移植神經段距近心端縫合處2 mm、4 mm、6 mm、8 mm處分別注入0.2 μl制備好的硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球。B組在右側離斷10 mm坐骨神經倒置后行外膜縫合。C組取D組制備神經行神經移植。D組取A組制備神經行神經移植后，按照A組的位置注入等量等滲0.9%氯化鈉注射液。術后4、8、12周進行大體標本觀察，術后12周行電生理檢測、HE染色、鍍銀染色及電鏡組織學檢測、圖像分析對比。結果制備所得硫酸軟骨素酶ABC微球表面光滑，球體大小各異且均勻，無粘連及成簇等現象，Weibull方程曲線顯示硫酸軟骨素酶ABC微球體外釋藥穩(wěn)定。采用硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學法去細胞同種異體神經移植能夠促進大鼠神經缺損處的軸突再生，提高神經修復的速度和質量，再生神經直徑較粗，粘連較輕，電生理檢測和組織學觀察顯示各項指標均優(yōu)于兩對照組，且較兩對照組修復效果更接近于自體神經移植。結論硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學法去細胞同種異體神經移植可以修復大鼠神經損傷。

周圍神經損傷；硫酸軟骨素酶ABC；化學去細胞異體神經；大鼠

周圍神經損傷后的軸突再生和功能恢復一直是外科棘手問題。有研究表明硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)能夠去除硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)對神經再生的抑制作用，而針對硫酸軟骨素酶ABC在體內易失活的特點將其制備成緩釋微球，可以更好地發(fā)揮作用。本實驗采用改良化學法去細胞同種異體神經(freeze-thrawed combined optimized acellular nerve，FTOAN)作為神經再生的三維支架，硫酸軟骨素酶ABC緩釋微球去除神經再生的抑制因素，觀察神經再生及修復情況。

材料和方法

1 實驗動物 成年雄性SD大鼠40只，體質量(240±20) g。由遼寧醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供(動物許可證號：SCXK[遼]2009-0004)。

2 主要試劑和儀器 聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(50∶50，6046，光華偉業(yè)實業(yè)有限公司)，硫酸軟骨素酶ABC、超速離心機(美國Sigma公司)，PBS緩沖液(珠海東大生物制品公司)，Tritonx-200(上海谷研生物科技有限公司)，聚乙烯醇(北京金鼎漢克科技發(fā)展有限公司)，低速離心機(日本KUBOTA公司)，分光光度計、掃描電鏡(德國BECKMAN公司)，AS 325多功能切片機、Histocetre 2包埋機(英國SHANDON公司)，光學顯微鏡(日本NIKON公司)等。

3 硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球的制備 參考張德盛等[1]方法，將聚乳酸-聚乙醇酸共聚物加入二氯甲烷(CH2Cl2)中，溶解后室溫下勻化成油相。將硫酸軟骨素酶ABC溶于雙蒸水后成水相，將后者加入上述油相中超聲勻化形成初乳。取聚乙烯醇和NaCl，加入雙蒸水，50℃水浴溶解，冷卻后加入初乳中，超聲勻化形成復乳。加入5%聚乙烯醇溶液，高速攪拌至乳化完全后，繼續(xù)在室溫下低速攪拌至CH2Cl2揮發(fā)完全，高速離心分離微球，用冷無菌三蒸水洗滌-離心共5次，常規(guī)凍干保存。觀測硫酸軟骨素酶ABC微球的形態(tài)，硫酸軟骨素酶ABC微球載藥量與包封率，硫酸軟骨素酶ABC微球的體外釋藥曲線。

4 實驗分組 實驗動物按隨機原則分為4組，每組10只。A組為硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球處理改良化學法去細胞同種異體神經移植組，B組為自體神經移植組，C組為改良化學法去細胞同種異體神經浸泡ChABC神經移植對照組，D組為改良化學法去細胞同種異體神經移植等滲0.9%氯化鈉注射液對照組。

5 神經移植段的制備 參考秦長江等[2]改良化學去細胞方法處理坐骨神經。取A、C、D 3組30只動物，無菌、麻醉條件下在右側股后部正中切口，手術顯微鏡下解剖坐骨神經，將坐骨神經銳性切斷，長度為10 mm，將兩斷端神經外膜用9-0無損傷縫合線縫于周圍組織防止回縮。將切取的神經用液氮反復凍融3次，隨后使用含SB-10的PBS液和含SB-16、Tritonx-200的PBS液進行化學處理2次后，放入4℃無菌PBS液(pH 7.2)，以組為單位分別暫時保存。D組制備神經浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH 7.4)中。

6 動物模型建立 使用10%水合氯醛腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，在無菌操作下A組神經缺損處取C組制備神經行異體神經移植，端端無張力外膜縫合。并在移植神經段距近心端縫合處2 mm、4 mm、6 mm、8 mm處分別注入0.2 μl制備好的硫酸軟骨素酶ABC-PLGA緩釋微球，逐層關閉切口縫合。B組分離切斷右側坐骨神經10 mm，倒置后行外膜縫合。C組神經缺損處取D組制備神經行異體神經移植。D組神經缺損處取A組制備神經行異體神經移植，并按照A組的位置注入等量等滲0.9%氯化鈉注射液。術后每天給予慶大霉素4×104U肌注，連續(xù)3 d預防感染。動物分籠飼養(yǎng)，不限制活動。

7 電生理檢測 術后12周用肌電圖儀進行檢測，刺激電極置于吻合口近側坐骨神經，記錄電極置于脛前肌，記錄神經肌肉動作電位，比較運動神經傳導速度、潛伏期和波幅。在坐骨切跡插入刺激電極，在脛前肌插入記錄電極。記錄神經干動作電位波形，測定潛伏期、波幅、神經傳導速度以及再生神經軸突面積(刺激參數：細電壓、單刺激、波寬0.3 ms、延時0.5 ms、刺激強度1.5 V)。每隔1 min重復電刺激，3次取平均值。

8 組織學觀察 術后觀察各組動物神經吻合口有無膨大或神經瘤形成、移植體及近遠端神經顏色光澤、與周圍組織有無粘連等。術后12周各組行電鏡組織學觀察再生神經纖維情況。取兩端神經移植段吻合口的組織，置于20%甲醛固定液中固定7 d后，脫水，石蠟包埋，4 ～ 6 μm半薄切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，所有實驗室據用表示，多組間比較用單因素χ2分析，兩組間比較用LSD法進行顯著性檢測。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 微球制備情況 掃描電鏡下觀察，硫酸軟骨素酶ABC微球表面光滑，球體大小各異且均勻，無粘連及成簇等現象(圖1)。硫酸軟骨素酶ABC微球的載藥量、包封率及體外釋藥：共制得4批硫酸軟骨素酶ABC微球，平均載藥量(14.30±1.75)×10-3%，平均包封率(53.73±0.94)%，硫酸軟骨素酶ABC微球在3周內的體外累積釋藥分數為0.863 5，釋藥平穩(wěn)。見圖2。

2 動物手術部位觀察 術后12周觀察手術部位。B組神經斷端無明顯神經瘤形成，移植段神經顏色接近正常，與周圍組織基本無粘連。A、C、D 3組神經斷端處均有再生神經纖維通過，A組較另外兩組再生神經直徑粗，其中D組與周圍組織粘連較其他兩組重，3組均未出現明顯的免疫排斥反應。見圖3。

3 電生理檢測 B組傳導速度、再生軸突橫切面積等檢測指標恢復均最明顯。A組恢復較好，但相較于B組有一定差距。C、D兩組恢復滯后，D組略好于C組。A、B兩組較C、D兩組再生神經恢復率、再生神經傳導速度恢復率明顯提高(P＜0.05)，見表1、表2。

4 組織學觀察 術后12周4組神經移植段HE染色均只有少量的淋巴細胞浸潤。結合鍍銀染色可見B組縱切片大量排列整齊的波浪狀纖維，橫切片可見再生神經軸突排列整齊、密集，呈中央或小束狀分布，束間有少量疏松結締組織充填，可見有微小血管分布。A組再生神經纖維排列規(guī)則，與B組相似，但較B組稀疏，其他表現基本相同。C、D兩組再生神經軸突較少，銀復染再生的神經纖維不如A、B兩組豐富。見圖4。

表1 各組動作電位的潛伏期、波幅和傳導速度比較Tab. 1 Com parison of the incubation period, am plitude and conduction velocity of each group action potential (, n=10)

表1 各組動作電位的潛伏期、波幅和傳導速度比較Tab. 1 Com parison of the incubation period, am plitude and conduction velocity of each group action potential (, n=10)

a P＜0.05, vs Group A; b P＜0.05, vs Group A

Group Latency (ms)Amplitude (mV)MCV (m/s) A 0.809±0.024 0.197±0.030 71.766±1.693 B 0.817±0.021 0.211±0.029 72.581±2.174 C 1.008±0.035a 0.138±0.027a 59.567±1.882a D 1.114±0.019b 0.122±0.013b 57.243±0.982b

表2 各組再生軸突橫切面積、再生神經恢復率、再生神經傳導速度恢復率比較Tab. 2 Com parison of regeneration of axons crosscutting area, regeneration of nerve recovery rate and recovery rate of regeneration of nerve conduction speed (, n=10)

表2 各組再生軸突橫切面積、再生神經恢復率、再生神經傳導速度恢復率比較Tab. 2 Com parison of regeneration of axons crosscutting area, regeneration of nerve recovery rate and recovery rate of regeneration of nerve conduction speed (, n=10)

a P＜0.05, vs Group A; b P＜0.05, vs Group A

Group Axons cross area (m2)Regeneration of nerve recovery rate (%) Regeneration of nerve conduction velocity recovery rate (%) A 0.477±0.030 63.60±4.00 68.35±1.61 B 0.485±0.031 64.67±4.13 69.12±2.07 C 0.348±0.026a 46.40±3.36a 56.73±1.99a D 0.337±0.043b 44.93±5.74b 54.52±0.93b

圖 1 掃描電鏡下硫酸軟骨素酶ABC微球形態(tài)Fig. 1 Scann ing electron m icroscope examination o f the chondroitinase ABC m icrospheres

圖 2 硫酸軟骨素酶ABC微球累積釋藥分數的W eibull方程擬合曲線Fig. 2 Cu rve fitting o f cum u lative d rug release ratio o f chondroitinase ABC microspheres with Weibu ll equations

圖 3 術后12周大鼠坐骨神經Fig. 3 Sciatic nerve of rats

圖 4 術后12周大鼠坐骨神經HE染色，箭頭示郎飛結(×100)Fig. 4 Sciatic nerve HE staining of rats, arrow node of Ranvier(×100)

圖 5 術后12周掃描電鏡下大鼠坐骨神經雪旺細胞(×8 000)Fig. 5 Schwann cells in sciatic nerve in rats under the SEM (×8 000)

5 超微結構觀察 術后12周A、B兩組電鏡下可見再生有髓軸突排列均勻密集，無髓神經軸突散在分布，雪旺細胞(Schwann cell，SC)胞核明顯，軸突內有線粒體、突觸小泡等細胞器，有突觸間隙和突觸皺襞形成，再生神經纖維聚集成束，外包有神經束膜。C、D兩組再生神經軸突粗細不等，無髓纖維比有髓纖維多見，軸突之間可見一個或多個未成熟的雪旺細胞，髓鞘薄，線粒體不豐富。見圖5。

討 論

周圍神經損傷后的治療與康復，歷來是創(chuàng)傷外科的重要研究課題?；仡欀車窠洆p傷修復的發(fā)展歷史，大致可以分為3個階段：第1階段是神經損傷處的機械與力學對合，強調神經縫合處不能有張力，以免在縫合處斷端形成瘢痕，阻礙軸突的再生；第2階段是顯微外科技術在周圍神經損傷修復中的應用，由于在手術顯微鏡下可以清楚地看到神經束的形態(tài)，從而使相同功能的神經束得以精確對合，即“神經束間縫合”；第3階段由于神經生理學和神經分子生物學技術的發(fā)展、眾多神經營養(yǎng)因子和神經趨化因子的發(fā)展與實驗研究，闡明了上述各種因子在周圍神經損傷后再生中的作用及神經損傷后再生的機制，從而使周圍神經損傷的治療與康復成為可能。

自體神經移植被認作周圍神經損傷修復的“金標準”，雖然術后效果最佳，但不可避免的需要損傷自身其他相對次要神經支。同理，用相似方法比如吻合血管、肌肉的神經移植術也會損傷相應組織。故異體神經移植表現出強大的研究發(fā)展空間。異體神經移植的最大障礙就是異體組織的免疫排斥反應。所以20世紀以來，學者們采用各種方法來降低移植體的抗原性并一一做了深入研究，實驗室效果令人滿意。

降低異體神經抗原性方法較多，冷凍法、化學法、輻照法、藥物處理以及甘油處理等方法，效果各有不同[3-6]。本實驗參考秦長江等[2]、王偉等[1]的方法結合凍融和化學方法的優(yōu)點制備去細胞異體神經，凍融處理后的神經其SC和髓鞘已破壞，降低了免疫原性，并完整保留了基底膜，再用化學試劑去除已崩解的SC及其髓鞘，進一步降低了免疫原性，并最大限度保留基底膜成分。實驗結果表明沒有明顯的免疫排斥反應，效果較為理想。本實驗應用此方法在操作過程及結果中均未出現明顯的免疫排斥反應，神經移植段與周圍組織粘連較輕，且僅有少量炎性細胞浸潤。此方法在本實驗中效果明顯并達到預期效果，也進一步驗證了此方法的可靠性。

研究表明利用化學法可有效去除同種異體神經中的雪旺細胞，降低移植宿主的免疫反應，同時保留較完整的細胞外基質，主要包括層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖等。雖然層粘連蛋白、纖維粘連蛋白有促進軸突再生的作用，但越來越多的證據表明CSPG能夠抑制神經軸突生長，有抑制細胞外基質、促進神經再生的作用[7]。如何增加周圍神經損傷后胞外基質中促進軸突再生的分子，去除抑制分子，對于神經的再生具有重要的意義。周圍神經系統(tǒng)中含有豐富的CSPG，CSPG由多種核心蛋白和與核心蛋白相連的葡糖胺聚糖(glucosaminoglycan，GAG)側鏈組成，當其結構完整時，才能抑制神經生長，因此分解其GAG側鏈或溶解其核心蛋白都會消除這種抑制作用。硫酸軟骨素酶ABC因其酶解作用部位的高度特異性和局限性，且生物相容性好、不良反應小，已用于脊柱等局部藥物治療的臨床研究中[8]。

硫酸軟骨素酶ABC是一種細菌胞外酶，它能特異性消化CSPG的GAG鏈，保留其蛋白核心。用ChABC消化GAG側鏈后，體外培養(yǎng)的神經元在CSPG底物上延伸軸突的能力明顯提高[9-10]。有學者通過實驗證實ChABC可降解CSPG，促進神經再生。并有研究表明，神經套接實驗中應用ChABC可以適當延長神經斷端間隙長度[11]。硫酸軟骨素酶ABC在體內容易失活，需局部長期用藥，目前采用的用藥方式均有不足之處。而緩釋微球這種給藥方式已經廣泛應用于各種試驗當中，是一種長期給藥的良好途徑。制備緩釋微球的過程中，首先要考慮的是預期的微球釋藥時間。時間太短或太長都不能發(fā)揮藥物效能，失去使用此方法的意義。針對神經損傷區(qū)CSPG其核心蛋白表達在14 d達峰值，糖胺多糖鏈持續(xù)時間達損傷后40 d以上的特點制備緩釋微球，能夠更好地去除掉胞外基質中的CSPG，有效地促進神經的再生和修復[12]。王紅輝等[13]用甲殼素橋接神經斷端后，在管內注入ChABC-PLGA，表明硫酸軟骨素酶ABC具有促進周圍神經再生的作用。本實驗中應用ChABC緩釋微球，體外檢測藥物釋放的高峰值為3周左右，能夠針對CSPG的特點發(fā)揮效力。A組應用硫酸軟骨素酶ABC緩釋微球處理移植神經段，去除CSPG程度最高、最徹底；而C組使用硫酸軟骨素酶ABC浸泡移植神經段，雖部分去除CSPG，但程度不高且不夠徹底。實驗結果也表明應用ChABC緩釋微球組神經生長速度、軸突再生能力均優(yōu)于未使用的陰性對照組。實驗證明了ChABC能夠提高軸突的生長速度，有效地促進周圍神經的再生修復和功能恢復。

綜上所述，本實驗采用改良化學法制備同種異體神經進行大鼠坐骨神經移植，未出現明顯免疫排斥反應。應用硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球組較未使用組，神經再生及修復的速度和質量均明顯提高。

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Repairing sciatic nerve in rats by acellular allogeneic nerve transplantation treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres

YU Guang-ming1, WANG Wei2, ZHANG Li2, ZHANG De-long1
1Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Jinzhou Central Hospital, Jinzhou 121013, Liaoning Province, China
Corresponding author: WANG Wei． Email: W eiw ang_Ly@yahoo．com．cn

ObjectiveTo investigate the feasibility of repairing sciatic nerve in rats by acellular allogeneic nerve transp lantation treated with chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres．MethodsChondroitinase ABC-PLGA m icrospheres w ere prepared by double emulsion methods． Forty adult male SD rats were randomly selected and divided into four groups (n=10): freeze-thrawed combined optim ized acellular nerve (FTOAN) group treated with chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres (Group A), autologous nerve transp lantation group (Group B), FTOAN soaking chondroitinase ABC group (Group C), FTOAN treated with normal saline group (Group D)． Ten m illimeters of nerve from the right sciatic nerve of animals in three groups (Group A, C, D) was artif cially cut and transp lanted with FTOAN． Group A and C w ere soaked in PBS, w hile group D w ere soaked in PBS solution containing 2 U/ml ChABC (pH 7．4)． Preparation line nerve of group C was taken by animals in group A and allograft nerve grafts were taken in both two groups, the outer membrane was sutured without tension, and preparated chondroitinase ABC-PLGA m icrospheres accounting for 0．2 μl was injected in the transp lanted neural segments from the seam s of proximal part of 2 mm, 4 mm, 6 mm, 8 mm respectively．Outer membrane suture w as taken by group B on the right side of 10 mm broken sciatic nerve after inversion． Preparation line nerve of group D w as taken by animals in group C and nerve-grafting w as taken in both tw o groups． Group D made allograft nerve grafts with preparation line nerve of group A, and equal amount of isotonic saline w as injected according to the position of group A． Gross specimen was observed 4,8,12 w eeks after operation． Electrophysiological detection, HE staining, silver staining, electron m icroscope histological detection and image analysis w ere compared 12 w eeks after operation．ResultsThe preparated chondroitinase ABC m icrospheres had smooth surface and sphere uniform sizes, and no adhesion and clusters w ere found． W eibull equation curve show edthe stability of in vitro release of chondroitinase ABC-PLGA microspheres． The axonal regeneration of neural defect in rats could be promoted by freeze-thrawed combined optim ized acellular nerve group treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres, the quality and speed of nerve repairing were also improved． The regeneration nerve was thicker in diameter and lighter in adhesion．Electrophysiological detection and histology observation showed that all indicators were better than the two compared groups, and also the repair effect was much closer to autologous nerve grafts．ConclusionFreeze-thrawed combined optimized acellular nerve group treated with chondroitinase ABC-PLGA microspheres can repair the nerve injury in rats．

peripheral nerve injury; chondroitinase ABC; chem ically acellular nerve allograft; rats

R 617

A

2095-5227(2014)08-0858-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.023

2014-04-25 08:34

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140425.0834.001.html

2013-11-25

于光明，男，在讀碩士。研究方向：周圍神經損傷修復。Email: 786741601@qq.com

王偉，男，博士，出站博士后，教授。Email: Weiwang_Ly@yahoo.com.cn