中藥白疕合劑對銀屑病樣動物模型影響的實(shí)驗(yàn)研究

盧益萍 李忻紅 馬賢德 董靈玉

銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚?。?］。現(xiàn)代研究證實(shí)，炎癥細(xì)胞浸潤、微血管改變及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖為銀屑病病理改變的三個(gè)特征［2］。從表皮細(xì)胞增殖及微血管角度進(jìn)行銀屑病機(jī)制研究是目前研究熱點(diǎn)，本研究通過建立銀屑病樣實(shí)驗(yàn)動物模型從血清中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量、cAMP/cGMP 比值及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growh factor，VEGF)水平方面，研究中藥白疕合劑治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

白疕合劑(院內(nèi)自制中藥濃縮煎劑，制劑號:Z05010105，主要組成:丹參15 g、地黃20 g、赤芍20 g、山豆根20 g、板藍(lán)根20 g、金銀花30 g、白茅根20 g、白花蛇舌草30 g、全蝎10 g、黃柏20 g);消銀顆粒(陜西康惠制藥股份有限公司，批號:Z20000019，組成:地黃、牡丹皮、當(dāng)歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、防風(fēng)、大青葉、紅花);cAMP、cGMP 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(上海越研生物科技有限公司提供，批號201210);VEGF ELISA檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司提供)。5%鹽酸普萘洛爾乳劑(純鹽酸普萘洛爾原料藥由天津力生制藥股份有限公司提供，批號H12020151，乳劑基質(zhì)由沈陽市日用化工廠提供，取鹽酸普萘洛爾原料藥加入基質(zhì)中配制)。

1.2 動物

健康豚鼠60 只，體重(300±30)g，雄雌各半，購自大連醫(yī)科大學(xué)，動物許可證號:SCXK(遼)2008-0002，分籠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 儀器

電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、低溫高速離心機(jī)(德國HERAEUS 生產(chǎn))、酶標(biāo)儀(奧地利Anthos Labtec Instruments 生產(chǎn))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康豚鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 組:(1)正常組;(2)模型組、(3)白疕合劑低劑量組;(4)白疕合劑中劑量組;(5)白疕合劑高劑量組;(6)消銀顆粒組。

1.4.2 動物造模 先脫去豚鼠背毛，約4 cm×4 cm大小，3 天后開始實(shí)驗(yàn)。對照組脫毛處僅外涂乳劑基質(zhì)，其余各組均外涂5%鹽酸普萘洛爾乳劑，范圍約3 cm×3 cm(1 cm×1 cm 用藥0.3 g)，2 次/天，連續(xù)3周。造模成功，造成豚鼠背部的銀屑病樣動物模型。

1.4.3 用藥 灌胃量4 ml/只，白疕合劑用藥量(成人每日100 ml/70 kg)，按照人與豚鼠體表面積比例進(jìn)行換算，計(jì)算得出豚鼠給藥劑量為每天7.74 ml/kg，以此濃度設(shè)定為中劑量組，低劑量組給藥劑量為3.87 ml/kg，高劑量組給藥劑量為15.48 ml/kg。陽性對照組按人鼠等效劑量灌胃，消銀顆粒組為0.81 g/kg。正常組與模型組豚鼠每日以等量生理鹽水灌胃。

1.4.4 ELISA 法檢測對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響 上述豚鼠未處死前取血，離心2000 r/min，取血清，采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果，根據(jù)結(jié)果計(jì)算cAMP/cGMP 比值。

1.4.5 ELISA 法檢測對血清血管內(nèi)皮生長因子水平的影響 上述豚鼠未處死前取血，離心2000 r/min，取血清，采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 版本軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，并進(jìn)行單因素方差分析。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 法。各樣本間比較應(yīng)用SNK 檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較用Dunnett-t 檢驗(yàn)，各組兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響

銀屑病豚鼠模型血清cAMP 含量均顯著降低，cGMP 含量均顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，白疕合劑各劑量組和消銀顆粒組cAMP 含量均顯著升高(P＜0.01)，cGMP 含量均降低(P＜0.01)，cAMP/cGMP 比值均升高(P＜0.01);消銀顆粒組與白疕合劑高劑量組cGMP 含量及cAMP 含量比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。消銀顆粒組與白疕合劑各劑量組cAMP/cGMP 比值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示白疕合劑能夠增高銀屑病豚鼠模型血清中cAMP 的含量，降低銀屑病模型豚鼠血清中cGMP 的含量，白疕合劑高劑量效果優(yōu)于消銀顆粒。白疕合劑能夠升高銀屑病模型豚鼠血清中cAMP/cGMP比值，且隨濃度的增高作用增強(qiáng)，對cAMP/cGMP比值的調(diào)節(jié)，白疕合劑與消銀顆粒無差別，見表1、圖1。

表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s，n=8)

表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s，n=8)

注:與空白對照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01;與消銀顆粒組比較，cP＜0.05;與消銀顆粒組比較，dP＞0.05

組別 cAMP(pmol/ml)cGMP(pmol/ml)cAMP/cGMP空白對照組 25.79±1.96b 1.91±0.09b 13.54±1.49 b模型組 5.18±0.35a 4.15±0.12a 1.25±0.09a白疕高劑量組 10.00±0.46abc 3.14±0.10abc 3.18±0.12abd白疕中劑量組 9.57±0.63ab 3.26±0.15ab 2.94±0.25abd白疕低劑量組 8.83±0.34ab 3.66±0.13ab 2.42±0.08abd消銀顆粒組 9.11±0.26ab 3.27±0.14ab 2.79±0.16 ab

圖1 各組血清cAMP/cGMP 比值的比較

2.2 對血清VEGF 水平的影響

銀屑病豚鼠模型血清VEGF 顯著高于正常組，造模成功。經(jīng)治療，中藥白疕合劑治療各劑量組與消銀顆粒組血清VEGF 均低于模型組(P＜0.01)，高劑量組與空白對照組無顯著性差異(P＞0.05)，低劑量組與消銀顆粒組無顯著性差異(P＞0.05)，但仍高于正常對照組(P＜0.05)，見表2。

表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

注:與正常對照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.01

組別 n VEGF(pg/ml)與消銀顆粒組比較空白對照組 8 68.21±3.71b＜0.01模型組 8 111.29±6.16a＜0.01白疕高劑量組 8 72.14±2.98b＜0.01白疕中劑量組 8 75.99±2.98ab＜0.05白疕低劑量組 8 82.31±4.60ab＞0.05消銀顆粒組 8 81.24±6.10 ab

3 討論

中藥白疕合劑為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院積數(shù)十年治療銀屑病的臨床經(jīng)驗(yàn)而研制成的院內(nèi)制劑，取得了確切滿意的療效，尤以進(jìn)展期效果最為顯著。課題組對該中藥多角度進(jìn)行了動物模型研究，以進(jìn)一步明確該中藥治療銀屑病的作用機(jī)制。

現(xiàn)在研究認(rèn)為，銀屑病表皮增生與cGMP/cAMP的比率增高有關(guān)［3］。環(huán)核苷酸cAMP 和cGMP 的調(diào)節(jié)對表皮細(xì)胞的生長和分化有重要意義。cAMP 通過激活磷酸化酶加速糖原代謝，從而抑制表皮有絲分裂，減慢轉(zhuǎn)換率，并抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。cGMP 在表皮細(xì)胞的增殖、分化中也起一定的作用。它能促進(jìn)表皮的增殖。cGMP 可以調(diào)節(jié)cAMP 的濃度及其信號通路，和cAMP 是人體對立的兩種調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在細(xì)胞增殖發(fā)動時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的cAMP 含量降低，cGMP含量增高。cAMP 抑制細(xì)胞生長繁殖，cGMP 則增強(qiáng)細(xì)胞繁殖。現(xiàn)在認(rèn)為，銀屑病表皮的增生不是簡單的由于cAMP 減少和cGMP 增高，更重要的是cGMP/cAMP 的比率增高所致。

VEGF 又稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，屬于生長因子中的血小板衍生的生長因子家族之一。在眾多血管生成因子中，VEGF 是唯一能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的因子，是目前已知最強(qiáng)的促血管生成因子［4］。VEGF 的主要作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，提高血管的通透性。銀屑病的病理損害中經(jīng)常有VEGF 及其受體表達(dá)的增高，這可能是銀屑病發(fā)病中一些炎癥反應(yīng)及真皮乳頭血管增生的分子基礎(chǔ)［5］。銀屑病患者皮損VEGF 增多，抑制患者VEGF 的生成可以用來治療該?。?］。

本研究結(jié)果顯示，中藥白疕合劑可能通過提高血清中cAMP 含量、降低cGMP 含量、調(diào)節(jié)cAMP/cGMP 比值抑制銀屑病表皮細(xì)胞增殖。通過降低血清VEGF 水平，從作用于微血管角度調(diào)節(jié)銀屑病發(fā)病的部分炎癥和免疫過程，取得療效。下一步課題組會繼續(xù)深入探討該藥對銀屑病的其它免疫學(xué)機(jī)制的相關(guān)影響。

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