柴貝止癇湯影響大鼠腦微血管內皮細胞乳腺癌耐藥蛋白、核因子p65表達的研究

鄢澤然 張青 王瀟慧 王越 聶莉媛 劉金民

難治性癲癇對多種抗癲癇藥物交叉耐藥，其可能的機制是血腦屏障上表達增加的多藥轉運體逆濃度梯度將抗癲癇藥物分子泵出血腦屏障，降低病灶處的藥物濃度，使藥物療效降低甚至失效，引起癲癇反復發(fā)作。長期使用抗癲癇藥物和癲癇反復發(fā)作均可增加多藥轉運體的表達。抑制血腦屏障上多藥轉運體的表達可能提高難治性癲癇的療效。

乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)屬于三磷酸腺苷依賴性膜轉運蛋白超家族成員，廣泛分布在腦微血管、小腸、肝臟、胎盤等組織和器官中［1］，與藥物的吸收、分布和代謝有密切關系。腦微血管內皮細胞上過度表達的BCRP可降低透過血腦屏障的抗癲癇藥物濃度。故在血腦屏障結構和功能完整的前提下，抑制BCRP 的表達可以增加抗癲癇藥物在腦組織中的濃度，對難治性癲癇的治療有重要意義。

柴貝止癇湯是劉金民教授在《醫(yī)學心悟》“定癇丸”的基礎上，繼承、吸收王永炎院士臨床經驗化裁而成，全方由柴胡、浙貝母、法半夏、天麻、石菖蒲、牡蠣、地龍七味藥物組成，主要功效是疏肝解郁，理氣化痰，開竅定癇。臨床應用發(fā)現(xiàn)，在抗癲癇藥物治療的基礎上添加中藥柴貝止癇湯可以抑制難治性癲癇患者的癇性發(fā)作，減少發(fā)作頻次，減輕發(fā)作程度，其療效優(yōu)于單用抗癲癇藥，因此推測其機制可能與二者協(xié)同增效有關。為探索柴貝止癇湯增敏抗癲癇藥物的機制，本研究擬采用地塞米松孵育大鼠腦微血管內皮細胞建立BCRP 高表達模型，觀察中藥柴貝止癇湯對BCRP 及BCRP 可能的調節(jié)因子核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

每批原代腦微血管內皮細胞需要SPF 級雄性Wistar 大鼠5 只，體重60～80 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。動物許可證號:SCXK-(軍)2012-0004;出籠單號:0000770、0001240。

1.2 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，12100-038)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，II 型膠原酶(Sigma，C6885)，0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸)(Sigma，T4049)，L-谷氨酰胺(Sigma，G6392)，噻唑藍(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(Sigma，M5655)，A 型明膠(Sigma，G2625)，地塞米松(Sigma，D4902)，肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司，H8060-1)，胰島素(Sigma，I5500)，內皮細胞生長支持 物(Sigma，E2759);TRIzol 試劑(Invitrogen，15596-026);逆轉錄cDNA 試劑盒(Fermentas，K1622);Real-time PCR 預混熒光染料(TOYOBO，QPK-212)。

1.3 抗體及引物

兔抗VIII 因子抗體(Santa Cruz，sc-33584)、兔抗BCRP 抗體(Santa Cruz，sc-25822)、兔抗NF-κB p65 抗體(Santa Cruz，sc-372)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Santa Cruz，sc-25778)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記anti-Rabbit 抗體(Santa Cruz，sc-2004)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記anti-Rabbit 抗體(Sigma，F(xiàn)0382)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 受試藥物

將地塞米松10 mg 溶于10 ml 無水乙醇，配制成1 mg/ml 濃儲液，使用時按比例稀釋成所需濃度。

柴貝止癇湯中藥配方顆粒(柴胡12 g、天麻15 g、浙貝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、牡蠣30 g、地龍6 g)購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。稱取10 g配方顆粒溶于100 ml D-Hank's 液中，煮沸后經定量濾紙過濾，烘干濾紙稱重，扣除被濾過的藥物質量，調節(jié)中藥水溶液濃度為10 mg/ml，0.22 μm 濾器過濾后備用。

1.5 大鼠腦微血管內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定

［2］所載方法，60～80 g Wistar 大鼠5 只，適應性飼養(yǎng)3 天后斷頭處死。75%的酒精浸泡頭顱三次，超凈臺內取腦，D-Hanks 液清洗，在沖洗液(8%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素、0.2 U/ml 胰島素、40 U/ml 肝素鈉及DMEM高糖培養(yǎng)基組成)中去除肉眼可見的血管和軟腦膜。分離大腦皮層灰質，在沖洗液中剪成1 mm3小塊，研磨器研磨25 次(上下為1 次)，研磨液用80 目(約178 μm)尼龍網篩過濾后再經200 目(約74 μm)網篩過濾。沖洗液沖洗200 目網篩上微血管段，洗液經1000 rpm 離心5 分鐘后棄上清，加入0.2%II 型膠原酶4 ml，37℃消化25 分鐘，1000 rpm離心5 分鐘，棄上清;沖洗液清洗2 次后加入4 ml完全培養(yǎng)基(20% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml鏈霉素、0.2 U/ml 胰島素、40 U/ml 肝素鈉、75 μg/ml內皮細胞生長支持物、2 μmol/ml L-谷氨酰胺及DMEM 高糖培養(yǎng)基組成)，滴管輕輕吹打均勻，接種于經2%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中。靜置3 天后第一次換液，以后每2 天換液1 次，7～10 天后細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底的80%～90%，經0.125%胰酶-EDTA 消化30 秒后傳代。傳至第3 代時接種至12 孔板(預包被明膠)內爬片，接種密度為2 ×104/ml。待細胞鋪滿80%玻片后，80%冷丙酮固定10 分鐘，0.3% Triton-X100 透膜20 分鐘，2%山羊血清(Gibco，16210-064)室溫封閉30 分鐘，勿洗，滴加anti-VIII 因子一抗(1∶50 稀釋)濕盒內4℃過夜，滴加FITC-anti-Rabbit 二抗(1∶30 稀釋)37℃避光孵育30分鐘，清洗后滴加10 μg/ml Hoechst33258(Sigma，B1155)避光室溫孵育15 分鐘，90%甘油封片，熒光顯微鏡(紫外光、藍光)觀察染色情況。經鑒定后的細胞用于實驗，傳代不超過第5 代。

1.6 地塞米松對腦微血管內皮細胞生長活力的影響

收集對數(shù)生長期的細胞，調整密度為4 ×104/ml接種至明膠包被的96 孔板，分設空白調零孔(無細胞)、地塞米松6 個濃度組(0 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L)，每組3 個復孔。待細胞爬滿孔底80%時換用含相應濃度地塞米松的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 小時。培養(yǎng)結束前4 小時加入MTT，培養(yǎng)結束后去除上清，加入二甲基亞砜，振蕩10 分鐘后酶標儀檢測各孔490 nm 處的吸光值(OD)。比較各濃度組的OD490，選擇對細胞生長活力影響較小的濃度進入下一步實驗。

細胞存活率=［(OD濃度組－OD調零孔)/(OD0nmol/L－OD調零孔)］×100%

1.7 BCRP 高表達腦微血管內皮細胞模型的建立

按參考文獻［3］所載方法和1.6 的結果，采用不同濃度的地塞米松作用腦微血管內皮細胞24 小時，觀察各濃度作用下BCRP、NF-κB p65 的表達情況。選擇誘導BCRP 高表達的濃度進入下一步實驗。

1.8 Western blot 檢測細胞BCRP 和NF-κB p65 的表達

調整細胞密度為1 ×105/ml 后接種至明膠包被的6 孔板，分設正常組、模型組及中藥10 μg/ml、100 μg/ml、500 μg/ml、1 mg/ml 四個劑量組，每組3個復孔，經造模和藥物干預后收集并裂解細胞，Bradford 法測定蛋白濃度，調節(jié)樣本蛋白濃度為5 μg/μl，每孔上樣12 μl 進行SDS-PAGE 電泳，轉印蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜(anti-BCRP 1∶50 稀釋，anti-NF-κB p65 1∶50 稀釋，anti-GAPDH 1∶1000 稀釋)，標記二抗(1∶5000 稀釋)，ECL 發(fā)光液顯影。條帶灰度值分析采用Image J軟件。

1.9 Real time-PCR 檢測細胞Bcrp mRNA 的表達

分組同前，總RNA 提取采用TRIzol 試劑，cDNA的合成采用Fermentas 公司逆轉錄試劑盒。PCR 反應體系(20 μl)配置:cDNA 模板1 μl，上、下游引物各1 μl，預混熒光染料10 μl，蒸餾水7 μl。BCRP 引物設計:Forward 5'-AGT CCG GAA AAC AGC TGA GA-3'，Reverse 5'-CCC ATC ACA ACG TCA TCT TG-3';GAPDH 引物設計:Forward 5'-GTG CCA GCC TCG TCT CAT AG-3'，Reverse 5'-CTT TGT CAC AAG AGA AGG CAG-3'。

1.10 觀察柴貝止癇湯對細胞BCRP、NF-κB p65 表達的影響

比較中藥各濃度組與模型組間BCRP、NF-κB p65 western blot 實驗電泳條帶灰度值的差異，說明柴貝止癇湯對BCRP、NF-κB p65 表達的影響;比較中藥各濃度組與模型組間Bcrp mRNA 擴增的值，說明柴貝止癇湯對Bcrp mRNA 擴增的影響。

1.11 統(tǒng)計學方法

結果用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計。平均值以(±s)表示，方差齊同各組間均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA 分析，兩兩比較采用One-Way ANOVA-LSD分析;方差不齊時各組間均數(shù)比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗，兩兩比較采用One-Way ANOVA-Games-Howell 分析。設置雙側檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腦微血管內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定

傳至第3 代時進行VIII 因子相關抗原免疫熒光鑒定，見圖1。視野中90%以上的細胞質被染上黃綠色熒光，細胞核染上藍色熒光(Hoechst 33258襯染)，符合血管內皮細胞VIII 因子分布特點。陰性對照細胞胞質未見黃綠色光。

圖1 第3 代大鼠腦微血管內皮細胞VIII 因子抗原免疫熒光鑒定

2.2 地塞米松對大鼠腦微血管內皮細胞活力的影響

地塞米松6 個濃度(0 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L)作用細胞24 小時后的細胞活力測定結果見表1。經Kruskal-Wallis H 檢驗，組間比較具有顯著性差異(χ2=33.115，P=0.000);經One-Way ANOVAGames-Howell 分析，10 nmol/L 以上濃度孵育大鼠腦微血管內皮細胞24 小時后，細胞的生長活力較0 nmol/L 組下降(P＜0.05)，其中10 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L 三個濃度對細胞生長活力影響較小，存活率在70%以上。

表1 地塞米松對細胞活力的影響(MTT 法)

2.3 地塞米松對大鼠腦微血管內皮細胞BCRP、NF-κB p65 表達的影響

選取地塞米松對細胞活力影響較小的三個濃度(10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L)孵育細胞24小時，比較地塞米松各濃度組BCRP、NF-κB p65 表達的情況(見圖2)。經Kruskal-Wallis H 檢驗，各濃度組間BCRP 表達有差異(χ2=8.641，P=0.034)，經One-Way ANOVA-Games-Howell 分析，50 nmol/L、100 nmol/L 濃度作用24 小時后BCRP 的表達較0 nmol/L組升高(P 值分別為0.043 和0.000)。經One-Way ANOVA-LSD 分析，NF-κB p65 的表達較0 nmol/L組降低(P 值分別為0.036 和0.039)。50 nmol/L與100 nmol/L 組間BCRP、NF-κB p65 的表達未見顯著差異(見表2)。為方便配制，后續(xù)實驗選用100 nmol/L 地塞米松作為干預濃度。

圖2 不同濃度地塞米松孵育細胞24 小時后BCRP、NF-κB p65 表達的Western blot 電泳條帶

表2 不同濃度地塞米松影響細胞BCRP、NF-κB p65 表達的情況

2.4 柴貝止癇湯對模型細胞BCRP、NF-κB p65 表達的影響

大鼠腦微血管內皮細胞經100 nmol/L 地塞米松孵育24 小時后，分別用柴貝止癇湯四個濃度梯度(10 μg/ml、100 μg/ml、500 μg/ml、1 mg/ml)干預24小時。組間方差齊同，經One-Way ANOVA-LSD 分析顯示，10 μg/ml、100 μg/ml 組細胞BCRP 的表達較模型組降低(對應P 值分別為0.014 和0.043)，1 mg/ml濃度組細胞NF-κB p65 的表達較模型組降低(P=0.021)。(見圖3和表3)

圖3 不同濃度柴貝止癇湯干預模型細胞24 小時后BCRP、NF-κB p65 表達的Western blot 電泳條帶

表3 不同濃度柴貝止癇湯影響模型細胞BCRP、NF-κB p65 表達的情況

2.5 柴貝止癇湯對模型細胞Bcrp mRNA 表達的調節(jié)作用

各組間方差齊同，經One-Way ANOVA-LSD 分析，模型組細胞Bcrp mRNA 的表達較正常組升高(P=0.000)，正常組的表達僅為模型組的0.23 倍。柴貝止癇湯10 μg/ml、100 μg/ml 兩個濃度組Bcrp mRNA 的表達均較模型組降低(P 值均為0.000)，分別為模型組的0.36 倍和0.29 倍。(見表4)

3 討論

BCRP 與癲癇、腫瘤、潰瘍性結腸炎等多種疾病的藥物轉運有關［4-6］，是繼P 糖蛋白之后發(fā)現(xiàn)的又一經典多藥轉運體。血腦屏障上的BCRP 參與了動物顱內苯巴比妥、唑尼沙胺、加巴噴汀、噻加賓和左乙拉西坦的轉運［7］，抑制BCRP 的表達可能增加動物顱內抗癲癇藥物濃度而提高難治性癲癇的療效。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，柴貝止癇湯可以降低大鼠腦內P 糖蛋白的表達，離體實驗亦觀察到柴貝止癇湯可下調經谷氨酸誘導的大鼠腦微血管內皮細胞P糖蛋白表達?；谥兴幎喟悬c的療效機制，本研究探索了柴貝止癇湯對大鼠腦微血管內皮細胞BCRP表達的影響，發(fā)現(xiàn)柴貝止癇湯可抑制地塞米松誘導的BCRP 及Bcrp mRNA 表達。

單一培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞能夠較好地保持在體特征，細胞間可以形成豐富的緊密連接、具有極少的胞飲囊泡和窗孔結構、擁有大量線粒體和豐富的跨膜轉運蛋白［8］，可以作為血腦屏障的單細胞體外模型。地塞米松作為孕烷X 受體的一種配體［9］，可直接激活孕烷X 受體信號通路上調BCRP的表達［3］。因此，本研究在培養(yǎng)正常大鼠腦微血管內皮細胞的基礎上，采用地塞米松孵育，模擬難治性癲癇血腦屏障上BCRP 的高表達，進而觀察柴貝止癇湯對BCRP 表達的調節(jié)作用。

在某些腫瘤細胞中，促炎性細胞因子可以通過激活孕烷X 受體而上調BCRP 的表達，增加BCRP的轉運活性，處于炎癥因子信號通路下游的NF-κB表達和活性也相應增加，提示孕烷X 受體、BCRP、NFκB 三者間可能存在相關性［10-11］，而NF-κB 等炎癥因子的活化已被證實在難治性癲癇的病理過程中具有重要作用［12］。因此，本研究在觀察中藥柴貝止癇湯影響B(tài)CRP 表達的同時也探索了對炎癥因子NF-κB p65 表達的影響，發(fā)現(xiàn)經中藥柴貝止癇湯高劑量(1 mg/ml)干預后的細胞NF-κB p65 表達較模型組下調。

表4 Bcrp mRNA 的表達情況(相對定量法)

相關研究認為BCRP 和NF-κB 的活化可能是疾病預后不良的標志［13-14］。柴貝止癇湯可以通過下調BCRP 和NF-κB 的表達來改善難治性癲癇的預后。藥物入胃，由胃運化為精微物質后隨氣、血、津、液的運行布散到全身。若先天腎氣和/或后天脾氣不足，氣、血、津、液運行不暢，出現(xiàn)氣郁、血瘀、痰凝，可阻礙藥物運化及在腦內的正常敷布。癲癇久治不愈、反復發(fā)作，往往引起氣、瘀、痰的相互搏結而不易根除，更加阻礙藥物轉運入腦。柴貝止癇湯中柴胡疏肝理氣，浙貝母、半夏合用可化難治之痰，地龍活血化瘀，石菖蒲引藥入腦，天麻、牡蠣平肝熄風定癇，全方與抗癲癇藥物合用，可通過改善氣滯、血瘀和痰凝來增進藥物在腦內的分布，進而改善難治性癲癇的預后。

參 考 文 獻

［1］Mao QC，Unadkat JD.Role of the breast cancer resistance protein (ABCG2)in drug transport［J］.The AAPS Journal，2005，7(1):E118-133.

［2］李衛(wèi)紅，青雪梅，華茜，等.大鼠腦微血管內皮細胞條件培養(yǎng)液對皮層神經元活性的影響以及通絡救腦注射液的干預作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(6):334-337.

［3］Narang VS，F(xiàn)raga C，Kumar N，et al.Dexamethasone increases expression and activity of multidrug resistance transporters at the rat blood-brain barrier［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2008，295(2):C440-C450.

［4］Sukowati CHC，Rosso N，Pascut D，et al.Gene and functional up-regulation of the BCRP/ABCG2 transporter in hepatocellular carcinoma［J］.BMC Gastroenterology，2012，12:160.

［5］Liu JYW，Thom M，Catarino CB，et al.Neuropathology of the blood-brain barrier and pharmaco-resistance in human epilepsy［J］.Brain，2012，135(10):3115-3133.

［6］Englund G，Jacobson A，Rorsman F，et al.Efflux transporters in ulcerative colitis:decreased expression of BCRP(ABCG2)and Pgp(ABCB1)［J］.Inflamm Bowel Dis，2007，13 (3):291-297.

［7］Nakanishi H，Yonezawa A，Matsubara K，et al.Impact of P-glycoprotein and breast cancer resistance protein on the brain distribution of antiepileptic drugs in knockout mouse models［J］.European Journal of Pharmacology，2013，710(1-3):20-28.

［8］趙康峰，王翀，孔建，等.不同血腦屏障模型的建立及其功能特點［J］.環(huán)境與健康雜志，2012，29(2):127-130.

［9］Bauer B，Hartz AMS，F(xiàn)ricker G，et al.Pregnane X receptor upregulation of P-glycoptrotein expression and transport function at the blood-brain barrier［J］.Mol Pharmacol，2004，66(3):413-419.

［10］Malekshah OM，Lage H，Bahrami AR，et al.PXR and NF-κB correlate with the inducing effects of IL-1β and TNF-α on ABCG2 expression in breast cancer cell lines［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2012，47(2):474-480.

［11］Mosaffa F，Kalalinia F，Lage H，et al.Pro-inflammatory cytokines interleukin-1β，interleukin6 and tumor necrosis factor-α alter the expression of ABCG2 in cervix and gastric cancer cells［J］.Mol Cell Biochem，2012，363(1-2):385-393.

［12］Das A，Wallace IV GC，Holmes C，et al.Hippocampal tissue of patients with refractory temporal lobe epilepsy is associated with astrocyte activation，inflammation，and altered expression of channels and receptors［J］.Neuroscience，2012，220:237-246.

［13］Lzzo JG，Wu X，Wu TT，et al.Therapy-induced expression of NF-kappa B portends poor prognosis in patients with localized esophageal cancer undergoing preoperative chemo-radiation［J］.Dis Esophagus，2009，22(2):127-132.

［14］Lee SH，Kim H，Hwang JH，et al.Breast cancer resistance protein expression is associated with early recurrence and decreased survival in resectable pancreatic cancer patients［J］.Pathology International，2012，62(3):167-175.