UPLC/Q-TOF-MS和PLS-DA在鴉片生物堿檢測(cè)及分類(lèi)判別中的應(yīng)用

劉翠梅，花鎮(zhèn)東，白燕平

（1.中國(guó)人民公安大學(xué) 刑事科學(xué)技術(shù)系，北京 100038；2.公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心國(guó)家毒品實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

鴉片（opium），又叫阿片，俗稱(chēng)大煙，源于罌粟植物蒴果，其所含主要生物堿嗎啡是生產(chǎn)毒品海洛因的原材料。鴉片中除嗎啡外還含有可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀4種常量生物堿和多種痕量生物堿如：牛心果堿、勞丹素、那碎因等。這些常量和痕量生物堿是推斷鴉片產(chǎn)地和海洛因的植物源產(chǎn)地（生產(chǎn)海洛因所用鴉片的產(chǎn)地）的重要判別指標(biāo)[1-2]。

傳統(tǒng)的鴉片中生物堿的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、液相色譜法（HPLC）[4]、毛細(xì) 管電泳法（CE）[5]等。由于受檢測(cè)方法的限制，以往鴉片樣品分析主要關(guān)注常量生物堿，而較少關(guān)注痕量生物堿。近年來(lái)液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)已廣泛用于毒品及生物樣品的分離分析[6-7]，新發(fā)展起來(lái)的超高效液相/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（UPLC/Q-TOF-MS），集UPLC快速有效的色譜分離能力和Q-TOF高分辨質(zhì)譜靈敏度高、定性能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)于一體[8]，必將成為毒品樣品特征分析最有效的分析手段之一。

本文首次建立了一種同時(shí)檢測(cè)鴉片樣品中17種常量和痕量生物堿UPLC/Q-TOF-MS方法，根據(jù)精確分子量、二級(jí)碎片離子、色譜保留時(shí)間分析來(lái)實(shí)現(xiàn)各生物堿的定性鑒定，并結(jié)合多變量模式識(shí)別方法中的偏最小二乘法（PLS-DA）找到不同地域鴉片樣品中生物堿的差異，建立了判別國(guó)產(chǎn)鴉片和緬甸產(chǎn)鴉片的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5600Triple TOF高分辨四極桿與飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó) AB Sciex）；Analyst TF 1.6 和 Multiquant數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)AB Sciex）；30A超高效液相色譜分析系統(tǒng)（日本島津）。

乙腈（色譜純）；甲酸銨（HPLC 級(jí)，純度＞99%）。

鹽酸嗎啡、鹽酸乙?？纱?、罌粟堿、磷酸可待因、那可?。ü膊课镒C鑒定中心）；波爾定堿（FLUKA，純度＞98%）；麗春花定堿（Chromadex，RG）；血根堿、原阿片堿（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度98%）；牛心果堿（凱利得生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司）純度 97%，DL-勞丹素（ChromaDex，RG）；氫可它寧（ChromaDex，RG）；DL-去甲基勞丹素（Aldrich）；金黃紫堇堿（Toronto Research Chemicals Inc）；可待民堿，那碎因，罌粟啶三種對(duì)照品為國(guó)家毒品實(shí)驗(yàn)室合成制得。

1.2 方法

1.2.1 樣品選取

本文選取了緬甸產(chǎn)鴉片200份，國(guó)內(nèi)產(chǎn)鴉片樣品78份。國(guó)產(chǎn)鴉片包括甘肅鴉片19份，河北17份，內(nèi)蒙23份，四川10份，貴州9份。

1.2.2 溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品配成1 mg/mL單標(biāo)儲(chǔ)備液，在5℃保存。移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始比例流動(dòng)相配成100μg/L的工作液。

1.2.3 樣品處理

鴉片樣品于55℃真空干燥，干燥后用瑪瑙研缽研磨均勻。稱(chēng)取150mg的鴉片樣品，加入15mL的甲醇，浸泡過(guò)夜，超聲30min，用初始比例的流動(dòng)相將樣品稀釋100倍，過(guò)0.2μm濾膜，進(jìn)UPLC/Q-TOF-MS分析。

1.3 條件

1.3.1 色譜條件

液相條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1mm×100mm，1.8μm）；進(jìn)樣體積：1μL；柱溫：40℃；流動(dòng)相 A：10 mM 甲酸銨（pH=5.1），流動(dòng)相 B：乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min， 85%B；1.0～6.0 min，85%～68%B；6.0～9.0 min，68%～30%B；9.0～10.0 min，30%～5%B；10.0～11.0 min，5%B；11.0～12.0min，5%B～85%B；12.5～15.0min，85%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子全掃描及二級(jí)質(zhì)譜掃描。 離子噴霧電壓：5.5kV；去簇電壓（DP）：80 V；噴霧溫度：600 ℃；霧化氣（N2，GS1）流速：50 psi；脫溶劑氣（N2，GS2）流速：50 psi，氣簾氣（CUR）流速：30 psi；質(zhì)量軸：100～1000amu；一級(jí)質(zhì)譜碰撞能量（CE）：10V；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量（CE）：40V±15V。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

各生物堿色譜峰處理采用peakview和multiquant軟件（美國(guó)AB Sciex），通過(guò)導(dǎo)入離子峰并適當(dāng)調(diào)整積分參數(shù)的方式完成色譜峰的識(shí)別與峰匹配，得到各個(gè)化合物的峰面積值。

不同產(chǎn)地鴉片樣品的分類(lèi)和變量的比較選用SIMCA-P軟件的偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 UPLC分離條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)初期，分別采用對(duì)甲醇、乙腈、甲酸體系、甲酸銨體系、乙酸銨體系、甲酸-甲酸銨體系、乙酸乙酸銨體系進(jìn)行比較，最終發(fā)現(xiàn)純甲酸銨和乙酸銨體系條件下各生物堿的分離條件最好，最終選取10 mM甲酸銨（pH=5.1）體系作為最終的緩沖體系。圖1是某鴉片樣品的UPLC-Q-TOF總離子流圖。

圖1 鴉片樣品的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

2.2 化合物的定性

UPLC/Q-TOF-MS質(zhì)譜可以提供化合物的保留時(shí)間、MS/MS碎片離子、精確質(zhì)量數(shù)等信息，這些信息可為化合物的準(zhǔn)確定性提供充分的依據(jù)。鴉片中生物堿的信息見(jiàn)表1。通過(guò)保留時(shí)間、準(zhǔn)確分子量和二級(jí)譜圖實(shí)現(xiàn)對(duì)各生物堿的定性。各生物堿的質(zhì)量數(shù)偏差均在2ppm以內(nèi)。

表1 生物堿的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 不同產(chǎn)地鴉片分類(lèi)結(jié)果

本文選取了國(guó)內(nèi)產(chǎn)的鴉片樣品78份和緬甸產(chǎn)鴉片200份。常量生物堿的平均色譜峰面積百分比均值約為10%～20%之間，痕量生物堿中牛心果堿、勞旦寧、勞丹素的平均面積百分比約為1%～3%之間，其他痕量生物堿的平均峰面積百分比約為0.05%～1%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地鴉片樣品生物堿平均峰面積百分比

通過(guò)AB 5600的Multiquant軟件導(dǎo)出各生物堿的峰面積數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P軟件對(duì)生物堿峰面積的數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，其中X矩陣為各生物堿的峰面積數(shù)據(jù)；Y矩陣為各樣品的類(lèi)別，將國(guó)內(nèi)產(chǎn)鴉片的類(lèi)別定義為1，緬甸產(chǎn)鴉片的類(lèi)別定義為2。X矩陣數(shù)據(jù)在計(jì)算前先進(jìn)行歸一化處理，歸一化方法為每個(gè)化合物的峰面積值減去其峰面積均值，除以其標(biāo)準(zhǔn)方差。

PLS-DA通過(guò)交叉驗(yàn)證的方式自動(dòng)擬合得到三個(gè)主成分（t1，t2，t3），三個(gè)主成分的 R2X 值（所解釋 X矩陣信息的比例）、R2Y值（所解釋Y矩陣信息的比例）和 Q2值（模型的預(yù)測(cè)能力）依次為：t1（R2X=16.3%，R2Y=57.3%，Q2=54.1%），t2（R2X=25%，R2Y=5.3%，Q2=8.9%），t3（R2X=8.6%，R2Y=3.7%，Q2=3.7%）。 三個(gè)主成分（t1，t2，t3）累積值（R2X=49.9%，R2Y=66.3%，Q2=59.7%）。Q2值是PLS-DA模型最重要的參數(shù)，Q2值越大表明模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)。結(jié)果表明該模型的預(yù)測(cè)能力較好。

依據(jù)PLS-DA模型的相關(guān)性系數(shù)值可以得到預(yù)測(cè)模型為 y=0.042×Morphine-0.17×Oripavine+0.24×Codeine+0.13×Hydrocotarnine+0.13×Reticuline+1.26×Codamine-0.1×Laudanidine+0.052×Narceine-0.14×Boldine-0.27×Thebaine+0.27×Cryptopine-0.19×Norlaudanosine-0.055×Papaveraldine-0.11×Laudanosine+0.079×Papaverine+0.050×Protopine+0.044×Noscapine（注：公式中各生物堿的值為其峰面積歸一化后得到的值）。模型的判別閾值為0，當(dāng)y＞0時(shí)為國(guó)內(nèi)產(chǎn)鴉片，當(dāng)y＜0時(shí)為緬甸產(chǎn)鴉片。該模型判別的正確率為96%，準(zhǔn)確度高。

從由t1和t2組成的“PLS-DA分類(lèi)圖”（見(jiàn)圖2）可以看出國(guó)內(nèi)產(chǎn)鴉片與緬甸產(chǎn)鴉片有明顯差異，國(guó)內(nèi)產(chǎn)鴉片主要分布在右上側(cè)，緬甸產(chǎn)鴉片主要分布在左下側(cè)。

圖2 鴉片樣品PLS-DA分類(lèi)圖

從“PLS-DA因子載荷圖”（見(jiàn)圖3）同時(shí)結(jié)合“不同產(chǎn)地鴉片樣品生物堿平均峰面積百分比”（見(jiàn)表2）可以看出，可待民堿、可待因、嗎啡、牛心果堿、罌粟堿在國(guó)產(chǎn)鴉片中的含量相對(duì)較高，而蒂巴因、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素在緬甸產(chǎn)鴉片中的含量相對(duì)較高。其中可待民堿、牛心果堿、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素這6種痕量生物堿含量在兩地區(qū)鴉片樣品中有顯著性差異，由此可見(jiàn)痕量生物堿是區(qū)分鴉片產(chǎn)地的重要變量。

圖3 鴉片樣品生物堿載荷圖

3 結(jié)論

綜上所述，本文首次建立了UPLC/Q-TOF-MS法測(cè)定鴉片中17種常量和痕量生物堿的方法，通過(guò)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片離子對(duì)各化合物定性分析，并采用PLS-DA法實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)鴉片和緬甸產(chǎn)鴉片的產(chǎn)地判別。結(jié)果表明：國(guó)產(chǎn)鴉片中可待因、可待民堿、嗎啡、牛心果堿、罌粟堿的含量相對(duì)較高，而緬甸產(chǎn)鴉片中蒂巴因、東罌粟堿、波爾定堿、去甲基勞丹素的含量相對(duì)較高。

該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，是一種有效的區(qū)分國(guó)產(chǎn)鴉片和緬甸產(chǎn)鴉片的手段，同時(shí)該研究也為進(jìn)一步建立國(guó)產(chǎn)海洛因和緬甸產(chǎn)海洛因的植物源產(chǎn)地判別方法提供了科學(xué)依據(jù)。

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