一株廣譜染料脫色菌的篩選

羅培　王玉海

摘要：為尋求適用性廣、性能高效的有染料降解菌株，以含多種混合染料的溶液來模擬成份復雜的印染廢水，馴化并分離出多株高效染料脫色菌。其中一株菌經(jīng)分子生物學鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans），對四種不同的活性染料溶液均表現(xiàn)出良好的脫色性。

關(guān)鍵詞：活性染料、菌株篩選、生物脫色、菌體吸附

【分類號】：X703

1 引言

紡織印染工業(yè)由于生產(chǎn)中廢水排放量大，因此成為最大的污染源和水資源消耗者之一，印染廢水難降解有機物含量高、污染物濃度高、色度較深，是非常難處理達標的工業(yè)廢水[1]。能對印染廢水中的有機物進行降解的技術(shù)，是治理印染工業(yè)廢水的重要前提。生物技術(shù)處理具有運行費用低、無二次污染等優(yōu)點，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，是尋求新處理方式的研究熱點、有巨大的潛力[3]。

為提高系統(tǒng)處理廢水能力，增強生物處理系統(tǒng)中微生物群落對高濃度難降解印染廢水有機物的能力，尋求優(yōu)化組合的菌落群體的途徑可以是[4]：（1） 尋求高效的降解菌株.（2） 尋找適用性廣泛的菌株。（3） 降解菌株的融合技術(shù)，創(chuàng)建復合式菌群，乃至人工合成高效脫色菌群落。

本文以四種典型的活性染料溶液作為模擬印染廢水，通過逐步加大染料濃度的方式富集培養(yǎng)，從某印染廢水處理廠的生物池活性污泥中馴化篩選到一株對多種活性染料均表現(xiàn)出較好脫色作用的細菌，以期為實際解決印染廢水提供科學依據(jù)。

2 實驗方法

2.1 高耐菌種的富集培養(yǎng)

配置200mL含混合染料總濃度為 20mg/L的LB培養(yǎng)基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉、PH=7.2，其中投入活性艷藍X-BR、活性艷藍KN-R、活性紅X-3B、活性金黃KN-G；四種染料濃度平均分配）。取污水處理生物池內(nèi)的樣品活性污泥10g投于含染料的富集培養(yǎng)基中。在35°C下，以150r/min 的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)2d。2d后取出后以1：9的比例接種到新的含混合染料總濃度40mg/L的富集培養(yǎng)基中。隨后混合染料總濃度逐步增加，分別為20mg/L、40mg/L 、80mg/L、160mg/L 、200mg/L（染料濃度平均分配）。當混合染料總濃度提升高達200mg/L時，培養(yǎng)2d后，移取10%至新的同染料濃度的富集培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)3d后，反復一次同樣過程。

2.2菌株的劃線、涂布、分離分純

以平板劃線法，將最后一次馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)液（染料濃度為200mg/L）劃線多個LB平板，放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35°C 培養(yǎng)。在48小時內(nèi)，每隔8小時連續(xù)觀察幾個劃線的培養(yǎng)平板，對比出現(xiàn)的不同特征菌落，并及時挑出劃線分離；再將劃線分離的每株菌用稀釋涂布法，可得到單個菌株的菌落平板。

2.3高效脫色菌的篩選

將分離純化的菌株分別接種一環(huán)于LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基投放活性紅X-3B（λmax=540nm），染料濃度50mg/L。接種好的培養(yǎng)基在150r/min、35°C下培養(yǎng)2d后按以下方式測算菌的脫色率：將脫色發(fā)酵液以10000r/min離心10min，取上清液在用紫外分光度計測其OD值，并用含相同染料濃度的空白發(fā)酵菌懸液作為對照、以不含染料的空白發(fā)酵液做分光度計調(diào)零，計算脫色率，以表示該菌對染料的脫色能力。按下面公式計算出脫色率η。

（脫色清液測值為At、含同染料濃度的空白發(fā)酵液測值為A0，后續(xù)的脫色研究實驗均用此法計算脫色率）

按上述實驗方法計算出脫色率最高的菌株，作為優(yōu)勢菌種。

2.4優(yōu)勢菌的菌種鑒定

本實驗的脫色優(yōu)勢菌的菌種鑒定采用應用分子生物學的手段對其進行16s rDNA測序鑒定，根據(jù)GenBank的數(shù)據(jù)庫對比，來確定菌種。

2.5脫色菌脫色廣譜性的測試

配制4份成份相同的LB培養(yǎng)基，分別加入四種不同的活性染料，染料濃度為50mg/L。將培養(yǎng)26h的菌懸液以3%的比例接種到四瓶分別含活性艷藍KN-R，活性金黃KN-R、活性紅X-3B、活性艷藍X-BR的LB培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基放恒溫培養(yǎng)搖床，調(diào)150r/min、35°C下培養(yǎng)48h小時后，放離心機離心后取出觀察，同時配制含相同染料濃度的空白發(fā)酵液做對比，觀察實驗現(xiàn)象。

3實驗結(jié)果與討論

3.1脫色菌的富集與分離

通過梯度逐步增加染料濃度的方式，從活性污泥中馴化、分離得到多株細菌，菌落特征各不相同，見表1：

表1 菌落形態(tài)

五銖菌U1、U2、U3、U4、U5在含染料濃度（活性紅X-3B）為50mg/L的LB培養(yǎng)基中的脫色率依次是17.64%、6.44%、44.83%、87.34%、22.78%，因此編號U4的菌株為脫色優(yōu)勢菌種，作為研究對象。

3.2高效脫色菌的鑒定與電子顯微鏡觀察

U4菌株經(jīng)16S rDNA生物分子技術(shù)鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans）；微桿菌屬；微桿菌科；放線菌目；放線菌綱；放線菌門。

3.5 U4菌脫色的廣譜性測試

分別含四種不同染料的發(fā)酵脫色液在離心后，上清液的染料顏色均明顯消褪，按照公式測試對四種染料的脫色率分別為：性艷藍KN-R為75.44%，活性金黃KN-R為82.51%、活性紅X-3B為85.82%、活性艷藍X-BR為70.77%。說明U4脫色菌的脫色活性較高，可作用于多種活性染料。

4.結(jié)論

本實驗對尋找適用廣泛的高效脫色菌株的方法進行探索，此篩選方式不同于其他只使用單種染料的馴化方式，篩選出的菌種脫色的應用性更廣泛，利于進一步的工業(yè)化應用。

參考文獻：

[1] 王輝，張明，李朗晨. 印染廢水處理技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢. 現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2009，（10）：279～280

[ 2] 陳榮圻. 現(xiàn)代活性染料與分散染料的發(fā)展. 染料與染色， 2007，（1）：5～13endprint

摘要：為尋求適用性廣、性能高效的有染料降解菌株，以含多種混合染料的溶液來模擬成份復雜的印染廢水，馴化并分離出多株高效染料脫色菌。其中一株菌經(jīng)分子生物學鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans），對四種不同的活性染料溶液均表現(xiàn)出良好的脫色性。

關(guān)鍵詞：活性染料、菌株篩選、生物脫色、菌體吸附

【分類號】：X703

1 引言

紡織印染工業(yè)由于生產(chǎn)中廢水排放量大，因此成為最大的污染源和水資源消耗者之一，印染廢水難降解有機物含量高、污染物濃度高、色度較深，是非常難處理達標的工業(yè)廢水[1]。能對印染廢水中的有機物進行降解的技術(shù)，是治理印染工業(yè)廢水的重要前提。生物技術(shù)處理具有運行費用低、無二次污染等優(yōu)點，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，是尋求新處理方式的研究熱點、有巨大的潛力[3]。

為提高系統(tǒng)處理廢水能力，增強生物處理系統(tǒng)中微生物群落對高濃度難降解印染廢水有機物的能力，尋求優(yōu)化組合的菌落群體的途徑可以是[4]：（1） 尋求高效的降解菌株.（2） 尋找適用性廣泛的菌株。（3） 降解菌株的融合技術(shù)，創(chuàng)建復合式菌群，乃至人工合成高效脫色菌群落。

本文以四種典型的活性染料溶液作為模擬印染廢水，通過逐步加大染料濃度的方式富集培養(yǎng)，從某印染廢水處理廠的生物池活性污泥中馴化篩選到一株對多種活性染料均表現(xiàn)出較好脫色作用的細菌，以期為實際解決印染廢水提供科學依據(jù)。

2 實驗方法

2.1 高耐菌種的富集培養(yǎng)

配置200mL含混合染料總濃度為 20mg/L的LB培養(yǎng)基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉、PH=7.2，其中投入活性艷藍X-BR、活性艷藍KN-R、活性紅X-3B、活性金黃KN-G；四種染料濃度平均分配）。取污水處理生物池內(nèi)的樣品活性污泥10g投于含染料的富集培養(yǎng)基中。在35°C下，以150r/min 的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)2d。2d后取出后以1：9的比例接種到新的含混合染料總濃度40mg/L的富集培養(yǎng)基中。隨后混合染料總濃度逐步增加，分別為20mg/L、40mg/L 、80mg/L、160mg/L 、200mg/L（染料濃度平均分配）。當混合染料總濃度提升高達200mg/L時，培養(yǎng)2d后，移取10%至新的同染料濃度的富集培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)3d后，反復一次同樣過程。

2.2菌株的劃線、涂布、分離分純

以平板劃線法，將最后一次馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)液（染料濃度為200mg/L）劃線多個LB平板，放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35°C 培養(yǎng)。在48小時內(nèi)，每隔8小時連續(xù)觀察幾個劃線的培養(yǎng)平板，對比出現(xiàn)的不同特征菌落，并及時挑出劃線分離；再將劃線分離的每株菌用稀釋涂布法，可得到單個菌株的菌落平板。

2.3高效脫色菌的篩選

將分離純化的菌株分別接種一環(huán)于LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基投放活性紅X-3B（λmax=540nm），染料濃度50mg/L。接種好的培養(yǎng)基在150r/min、35°C下培養(yǎng)2d后按以下方式測算菌的脫色率：將脫色發(fā)酵液以10000r/min離心10min，取上清液在用紫外分光度計測其OD值，并用含相同染料濃度的空白發(fā)酵菌懸液作為對照、以不含染料的空白發(fā)酵液做分光度計調(diào)零，計算脫色率，以表示該菌對染料的脫色能力。按下面公式計算出脫色率η。

（脫色清液測值為At、含同染料濃度的空白發(fā)酵液測值為A0，后續(xù)的脫色研究實驗均用此法計算脫色率）

按上述實驗方法計算出脫色率最高的菌株，作為優(yōu)勢菌種。

2.4優(yōu)勢菌的菌種鑒定

本實驗的脫色優(yōu)勢菌的菌種鑒定采用應用分子生物學的手段對其進行16s rDNA測序鑒定，根據(jù)GenBank的數(shù)據(jù)庫對比，來確定菌種。

2.5脫色菌脫色廣譜性的測試

配制4份成份相同的LB培養(yǎng)基，分別加入四種不同的活性染料，染料濃度為50mg/L。將培養(yǎng)26h的菌懸液以3%的比例接種到四瓶分別含活性艷藍KN-R，活性金黃KN-R、活性紅X-3B、活性艷藍X-BR的LB培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基放恒溫培養(yǎng)搖床，調(diào)150r/min、35°C下培養(yǎng)48h小時后，放離心機離心后取出觀察，同時配制含相同染料濃度的空白發(fā)酵液做對比，觀察實驗現(xiàn)象。

3實驗結(jié)果與討論

3.1脫色菌的富集與分離

通過梯度逐步增加染料濃度的方式，從活性污泥中馴化、分離得到多株細菌，菌落特征各不相同，見表1：

表1 菌落形態(tài)

五銖菌U1、U2、U3、U4、U5在含染料濃度（活性紅X-3B）為50mg/L的LB培養(yǎng)基中的脫色率依次是17.64%、6.44%、44.83%、87.34%、22.78%，因此編號U4的菌株為脫色優(yōu)勢菌種，作為研究對象。

3.2高效脫色菌的鑒定與電子顯微鏡觀察

U4菌株經(jīng)16S rDNA生物分子技術(shù)鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans）；微桿菌屬；微桿菌科；放線菌目；放線菌綱；放線菌門。

3.5 U4菌脫色的廣譜性測試

分別含四種不同染料的發(fā)酵脫色液在離心后，上清液的染料顏色均明顯消褪，按照公式測試對四種染料的脫色率分別為：性艷藍KN-R為75.44%，活性金黃KN-R為82.51%、活性紅X-3B為85.82%、活性艷藍X-BR為70.77%。說明U4脫色菌的脫色活性較高，可作用于多種活性染料。

4.結(jié)論

本實驗對尋找適用廣泛的高效脫色菌株的方法進行探索，此篩選方式不同于其他只使用單種染料的馴化方式，篩選出的菌種脫色的應用性更廣泛，利于進一步的工業(yè)化應用。

參考文獻：

[1] 王輝，張明，李朗晨. 印染廢水處理技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢. 現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2009，（10）：279～280

[ 2] 陳榮圻. 現(xiàn)代活性染料與分散染料的發(fā)展. 染料與染色， 2007，（1）：5～13endprint

摘要：為尋求適用性廣、性能高效的有染料降解菌株，以含多種混合染料的溶液來模擬成份復雜的印染廢水，馴化并分離出多株高效染料脫色菌。其中一株菌經(jīng)分子生物學鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans），對四種不同的活性染料溶液均表現(xiàn)出良好的脫色性。

關(guān)鍵詞：活性染料、菌株篩選、生物脫色、菌體吸附

【分類號】：X703

1 引言

紡織印染工業(yè)由于生產(chǎn)中廢水排放量大，因此成為最大的污染源和水資源消耗者之一，印染廢水難降解有機物含量高、污染物濃度高、色度較深，是非常難處理達標的工業(yè)廢水[1]。能對印染廢水中的有機物進行降解的技術(shù)，是治理印染工業(yè)廢水的重要前提。生物技術(shù)處理具有運行費用低、無二次污染等優(yōu)點，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，是尋求新處理方式的研究熱點、有巨大的潛力[3]。

為提高系統(tǒng)處理廢水能力，增強生物處理系統(tǒng)中微生物群落對高濃度難降解印染廢水有機物的能力，尋求優(yōu)化組合的菌落群體的途徑可以是[4]：（1） 尋求高效的降解菌株.（2） 尋找適用性廣泛的菌株。（3） 降解菌株的融合技術(shù)，創(chuàng)建復合式菌群，乃至人工合成高效脫色菌群落。

本文以四種典型的活性染料溶液作為模擬印染廢水，通過逐步加大染料濃度的方式富集培養(yǎng)，從某印染廢水處理廠的生物池活性污泥中馴化篩選到一株對多種活性染料均表現(xiàn)出較好脫色作用的細菌，以期為實際解決印染廢水提供科學依據(jù)。

2 實驗方法

2.1 高耐菌種的富集培養(yǎng)

配置200mL含混合染料總濃度為 20mg/L的LB培養(yǎng)基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉、PH=7.2，其中投入活性艷藍X-BR、活性艷藍KN-R、活性紅X-3B、活性金黃KN-G；四種染料濃度平均分配）。取污水處理生物池內(nèi)的樣品活性污泥10g投于含染料的富集培養(yǎng)基中。在35°C下，以150r/min 的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)2d。2d后取出后以1：9的比例接種到新的含混合染料總濃度40mg/L的富集培養(yǎng)基中。隨后混合染料總濃度逐步增加，分別為20mg/L、40mg/L 、80mg/L、160mg/L 、200mg/L（染料濃度平均分配）。當混合染料總濃度提升高達200mg/L時，培養(yǎng)2d后，移取10%至新的同染料濃度的富集培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)3d后，反復一次同樣過程。

2.2菌株的劃線、涂布、分離分純

以平板劃線法，將最后一次馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)液（染料濃度為200mg/L）劃線多個LB平板，放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35°C 培養(yǎng)。在48小時內(nèi)，每隔8小時連續(xù)觀察幾個劃線的培養(yǎng)平板，對比出現(xiàn)的不同特征菌落，并及時挑出劃線分離；再將劃線分離的每株菌用稀釋涂布法，可得到單個菌株的菌落平板。

2.3高效脫色菌的篩選

將分離純化的菌株分別接種一環(huán)于LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基投放活性紅X-3B（λmax=540nm），染料濃度50mg/L。接種好的培養(yǎng)基在150r/min、35°C下培養(yǎng)2d后按以下方式測算菌的脫色率：將脫色發(fā)酵液以10000r/min離心10min，取上清液在用紫外分光度計測其OD值，并用含相同染料濃度的空白發(fā)酵菌懸液作為對照、以不含染料的空白發(fā)酵液做分光度計調(diào)零，計算脫色率，以表示該菌對染料的脫色能力。按下面公式計算出脫色率η。

（脫色清液測值為At、含同染料濃度的空白發(fā)酵液測值為A0，后續(xù)的脫色研究實驗均用此法計算脫色率）

按上述實驗方法計算出脫色率最高的菌株，作為優(yōu)勢菌種。

2.4優(yōu)勢菌的菌種鑒定

本實驗的脫色優(yōu)勢菌的菌種鑒定采用應用分子生物學的手段對其進行16s rDNA測序鑒定，根據(jù)GenBank的數(shù)據(jù)庫對比，來確定菌種。

2.5脫色菌脫色廣譜性的測試

配制4份成份相同的LB培養(yǎng)基，分別加入四種不同的活性染料，染料濃度為50mg/L。將培養(yǎng)26h的菌懸液以3%的比例接種到四瓶分別含活性艷藍KN-R，活性金黃KN-R、活性紅X-3B、活性艷藍X-BR的LB培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基放恒溫培養(yǎng)搖床，調(diào)150r/min、35°C下培養(yǎng)48h小時后，放離心機離心后取出觀察，同時配制含相同染料濃度的空白發(fā)酵液做對比，觀察實驗現(xiàn)象。

3實驗結(jié)果與討論

3.1脫色菌的富集與分離

通過梯度逐步增加染料濃度的方式，從活性污泥中馴化、分離得到多株細菌，菌落特征各不相同，見表1：

表1 菌落形態(tài)

五銖菌U1、U2、U3、U4、U5在含染料濃度（活性紅X-3B）為50mg/L的LB培養(yǎng)基中的脫色率依次是17.64%、6.44%、44.83%、87.34%、22.78%，因此編號U4的菌株為脫色優(yōu)勢菌種，作為研究對象。

3.2高效脫色菌的鑒定與電子顯微鏡觀察

U4菌株經(jīng)16S rDNA生物分子技術(shù)鑒定為副氧化微桿菌（Microbacterium paraoxydans）；微桿菌屬；微桿菌科；放線菌目；放線菌綱；放線菌門。

3.5 U4菌脫色的廣譜性測試

分別含四種不同染料的發(fā)酵脫色液在離心后，上清液的染料顏色均明顯消褪，按照公式測試對四種染料的脫色率分別為：性艷藍KN-R為75.44%，活性金黃KN-R為82.51%、活性紅X-3B為85.82%、活性艷藍X-BR為70.77%。說明U4脫色菌的脫色活性較高，可作用于多種活性染料。

4.結(jié)論

本實驗對尋找適用廣泛的高效脫色菌株的方法進行探索，此篩選方式不同于其他只使用單種染料的馴化方式，篩選出的菌種脫色的應用性更廣泛，利于進一步的工業(yè)化應用。

參考文獻：

[1] 王輝，張明，李朗晨. 印染廢水處理技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢. 現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2009，（10）：279～280

[ 2] 陳榮圻. 現(xiàn)代活性染料與分散染料的發(fā)展. 染料與染色， 2007，（1）：5～13endprint