促紅細(xì)胞生成素（Ep O）對葉酸在Caco-2細(xì)胞中跨膜轉(zhuǎn)運的影響

言君凱靳桂英李豪男楊青△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系 上海 200433；2金日成綜合大學(xué)生命科學(xué)系 平壤)

促紅細(xì)胞生成素（Ep O）對葉酸在Caco-2細(xì)胞中跨膜轉(zhuǎn)運的影響

言君凱1靳桂英1李豪男2楊青1△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系 上海 200433；2金日成綜合大學(xué)生命科學(xué)系 平壤)

目的采用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2單細(xì)胞層模型觀察促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對葉酸跨膜轉(zhuǎn)運的影響。方法采用Caco-2單層細(xì)胞模型,觀察不同劑量EPO(0.3、1、3 U/m L)處理對葉酸在攝取與外排雙向轉(zhuǎn)運方面的影響。通過real time-PCR與Western blot觀察EPO處理對質(zhì)子偶聯(lián)的葉酸轉(zhuǎn)運體(proton coupled folate transporter,PCFT)、還原葉酸載體(reduced folate carrier,RFC)以及多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)表達(dá)的影響。結(jié)果EPO在劑量0.3～3 U/m L范圍內(nèi)可劑量依賴地增加葉酸在攝取方向的轉(zhuǎn)運,增幅分別為31.6%、61.5%和120.5%。高劑量EPO(3 U/mL)對葉酸在外排方向的轉(zhuǎn)運也具有促進(jìn)作用,增幅為56.9%,而中低劑量EPO (1、0.3 U/m L)對葉酸外排無明顯作用。葉酸轉(zhuǎn)運體PCFT、RFC及MRP2均受EPO影響而表達(dá)上調(diào),并呈劑量依賴和時間依賴關(guān)系。結(jié)論EPO可上調(diào)葉酸的攝取并呈劑量依賴關(guān)系,高劑量EPO對葉酸的攝取與外排具有雙向促進(jìn)作用。

葉酸； 促紅細(xì)胞生成素(EPO)； Caco-2細(xì)胞； 葉酸轉(zhuǎn)運體

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietinm,EPO)是臨床上治療腎性貧血的經(jīng)典藥物,其發(fā)揮作用的主要機制是在骨髓內(nèi)刺激造血細(xì)胞的分化成熟［1］。自20世紀(jì)90年代初EPO開始用于治療腎性貧血以來,其極大地改善了患者的預(yù)后情況和生存質(zhì)量。隨著時間的推移,EPO治療的個體差異性越發(fā)受到關(guān)注。有文獻(xiàn)指出,在某些患者體內(nèi)鐵、葉酸等造血營養(yǎng)素的代謝水平是影響EPO療效的重要因素之一［2-3］。鑒于這些造血營養(yǎng)素不能為人體自身合成且只能由外源性食物供給,口服吸收便成為整個代謝過程中的關(guān)鍵［4］。近年的研究發(fā)現(xiàn),EPO具有調(diào)控體內(nèi)鐵代謝的功能［5-6］,它可直接促進(jìn)鐵的口服吸收［7］,但是葉酸的口服吸收是否也受到EPO調(diào)控仍不得而知。

基于葉酸的吸收主要在腸道進(jìn)行,涉及的轉(zhuǎn)運體包括還原葉酸載體(reduced folate carrier, RFC)［8-9］、質(zhì)子偶聯(lián)的葉酸轉(zhuǎn)運體(proton coupled folate transporter,PCFT)［10-11］及多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2, MRP2)［12］。RFC與PCFT負(fù)責(zé)將葉酸從腸腔攝取轉(zhuǎn)運至血漿,而MRP2則將葉酸從血漿外排回腸腔［4］。動物實驗顯示體內(nèi)EPO水平與葉酸吸收之間存在聯(lián)系。在先天葉酸吸收不良(hereditary folate malabsorption,HFM)的小鼠模型中,其血清EPO水平相對較高,提示EPO增高可能與機體對葉酸吸收不良的代償有關(guān)［13］。內(nèi)源性EPO多由腎臟分泌,在5/6腎臟切除的小鼠模型中,動物腸道內(nèi)葉酸轉(zhuǎn)運體PCFT與RFC均有下調(diào),考慮可能因EPO分泌不足所致［14］。因此,我們提出假設(shè),EPO對葉酸的腸道吸收具有一定調(diào)控作用,且可能與葉酸轉(zhuǎn)運體蛋白表達(dá)的變化有關(guān)。

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2來源于人類結(jié)腸和直腸癌細(xì)胞,其在形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)及滲透性等方面與小腸上皮細(xì)胞相似。藥物透過Caco-2細(xì)胞單層的體外過程與藥物口服后在腸中的吸收和代謝有良好的相關(guān)性,因此Caco-2細(xì)胞成為研究藥物吸收、轉(zhuǎn)運和代謝最經(jīng)典的體外細(xì)胞模型之一［15］。該細(xì)胞模型在涉及葉酸吸收與EPO作用的研究中均有應(yīng)用［7,16-17］,是體外研究EPO影響葉酸吸收的理想工具。

綜上所述,本實驗擬采用Caco-2單層細(xì)胞模型觀察EPO對葉酸腸道吸收的影響,以期對拓寬EPO作用機制的認(rèn)識、深化了解腎性貧血患者體內(nèi)的病理生理改變有所幫助。

材料和方法

藥品與試劑葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(98%HPLC,美國Sigma公司)；促紅細(xì)胞生成素(3 000 U,上海市第九人民醫(yī)院)；DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、青-鏈霉素和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)。HPLC所用的乙腈及甲醇均為色譜純級別。

設(shè)備和儀器安捷倫1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；伯樂IQ5實時定量PCR(美國Bio-Rad公司)；Typhoon FLA9000(美國GE Healthcare公司)；24孔Transwell(底面積0.6 cm2,孔徑0.45μm)、跨膜電阻儀(美國Millipore公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞株來源于ATCC(HTB-37),采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、0.1%青-鏈霉素)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(相對濕度90%)。待細(xì)胞生長至80%～90%匯合時,用PBS沖洗2～3次,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,按1∶5傳代。用于轉(zhuǎn)運實驗的細(xì)胞按5×104/孔的密度接種至Transwell,隔天換液,連續(xù)培養(yǎng)21～23天,滿足跨膜電阻大于300Ω·cm2的膜用于葉酸轉(zhuǎn)運實驗。

EpO處理轉(zhuǎn)運實驗前48 h,移去Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)基,用PBS沖洗2～3次,在EPO處理組細(xì)胞的頂端側(cè)(apical side,AP)加入400μL空白無血清培養(yǎng)基,在細(xì)胞的基底側(cè)(basolateral side, BL)加入600μL含EPO(0.3、1、3 U/m L)的無血清培養(yǎng)基,對照組細(xì)胞AP側(cè)與BL側(cè)均替換成空白無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實驗。

葉酸轉(zhuǎn)運試驗用PBS配制濃度為10μmol/L的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液并調(diào)節(jié)p H至6.0或7.4,分別用于AP→BL的吸收方向和BL→AP的外排方向的轉(zhuǎn)運實驗。AP→BL轉(zhuǎn)運：AP側(cè)加入400μL葉酸標(biāo)品(p H 6.0),BL側(cè)加入600μL空白PBS(p H 7.4)；BL→AP轉(zhuǎn)運：BL側(cè)加入600μL葉酸標(biāo)品(p H 7.4),AP側(cè)加入400μL空白PBS(p H 6.0)。Transwell培養(yǎng)板置于37℃、60 r/min的水浴恒溫振蕩器中,在30、60、90、120 min時分別取樣100 μL待檢,并補加相應(yīng)空白PBS。

HpLC法檢測樣品中葉酸含量于相應(yīng)時間點取100μL待測樣品,9391×g離心10 min,取上清過濾后用高效液相色譜儀測定葉酸含量。色譜條件：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫25℃；檢測波長280 nm,流動相50 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(p H 6.3)∶乙腈(95∶5),流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量80μL。

數(shù)據(jù)處理根據(jù)文獻(xiàn)計算葉酸透過Caco-2細(xì)胞單層的表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficients,Papp)［18］,線性條件下參考公式1,非線性條件下參考公式2。

公式1：Papp=(d Q/d t)/(A×C0)。其中,d Q/ d t為藥物滲透速率；A為膜面積(0.6 cm2)；C0是葉酸在供給側(cè)的初濃度(10μmol/L)。

公式2：CR(t)=［M/(VD+VR)］+［CR(0)-(M/ (VD+VR)］e-Papp A(1/VD+1/VR)t。其中,VD是供給側(cè)溶液體積(AP側(cè)=400μL；BL側(cè)=600μL),VR為接收側(cè)溶液體積(AP側(cè)=400μL；BL側(cè)=600μL),A為膜面積(0.6 cm2),M為葉酸在轉(zhuǎn)運體系中的總量,CR(0)為葉酸在初始時刻(t=0)接收側(cè)的濃度, CR(t)為葉酸在t時刻接收側(cè)的濃度。

realtime-pCR檢測葉酸轉(zhuǎn)運體mRNA表達(dá)將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板內(nèi),待80%～90%匯合后進(jìn)行EPO處理。EPO處理方式分3種：(1)觀察EPO作用的劑量依賴關(guān)系：EPO處理劑量分低(0.3 U/m L)、中(1 U/m L)、高(3 U/m L)3組,處理時間48 h；(2)觀察EPO作用的時間依賴關(guān)系：EPO處理劑量為1 U/m L,處理時間為4、24、48 h；(3)觀察生理劑量下EPO的長期作用：EPO劑量為10 m U/m L,連續(xù)培養(yǎng)15天。采用Trizol法提取Caco-2細(xì)胞內(nèi)總RNA。取1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并使用SYBER Green法對目的基因進(jìn)行相對定量,β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min,96℃變性1 min,56℃退火1 min, 72℃延伸1 min,反應(yīng)循環(huán)35次。數(shù)據(jù)通過MyIQ軟件分析,引物信息如表1所示。

Westernblot檢測葉酸轉(zhuǎn)運體蛋白表達(dá)將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi),待80%～90%匯合后進(jìn)行EPO處理。EPO處理方式同上。采用文獻(xiàn)報道方法提取膜蛋白［16］,經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后進(jìn)行Western blot反應(yīng)。SDS-PAGE(10%)電泳上樣量為40μg,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h,加入PCFT一抗(1∶1 000,美國Abcam公司)、RFC一抗(1∶1 000,美國Abcam公司)、MRP2一抗(1∶1 000,美國CST公司),4℃過夜,經(jīng)PBSTween(0.3%)洗膜后孵育,加入相應(yīng)二抗并使用ECL PLUS試劑盒顯色(美國GE Healthcare公司)。雜交信號由Typhoon FLA9000掃描,條帶密度由Image Quant軟件分析,以GAPDH作為內(nèi)參,數(shù)據(jù)以目的蛋白/GAPDH比值表示。

統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以x—±s表示,重復(fù)3次以上。兩組數(shù)據(jù)間用差異用t檢驗分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,統(tǒng)計分析使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。

結(jié) 果

EpO處理對葉酸轉(zhuǎn)運的影響低、中、高3個劑量EPO(0.3、1、3 U/m L)處理Caco-2細(xì)胞后,對該方向上雙向轉(zhuǎn)運的變化見圖1。在AP→BL攝取方向上,葉酸的轉(zhuǎn)運量隨時間呈非線性增長,90 min后逐漸趨于飽和,EPO處理上調(diào)了葉酸在該方向的轉(zhuǎn)運并呈劑量依賴關(guān)系(圖1 A)。對照組及EPO處理低、中、高3個劑量組在120 min時的累積轉(zhuǎn)運量分別為(117.9±15.8)、(154.7±8.4)、(189.9± 6.8)和(258.0±7.6)pmol,EPO處理后的增幅分別為31.6%、61.5%和120.5%,中、高劑量EPO處理所致的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)。在BL→AP外排方向上,葉酸的轉(zhuǎn)運量隨時間呈線性增長,低、中劑量EPO處理對該方向上的葉酸轉(zhuǎn)運無明顯影響,而高劑量EPO處理可上調(diào)葉酸轉(zhuǎn)運(圖1C)。對照組及EPO處理低、中、高3個劑量組在120 min時的累積轉(zhuǎn)運量分別為(86.4±4.2)、(96.2±18.2)、(104.3±27.9)和(135.6±20.5)pmol,EPO處理后的增幅分別為11.3%、20.7%和56.9%,僅高劑量EPO所致差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D)。在Papp方面,各時間點計算所得的結(jié)果如表2所示。在AP→BL吸收方向上,Papp值隨時間變化逐漸減小,說明葉酸轉(zhuǎn)運體在此過程中有逐漸飽和的趨勢,同時Papp值也隨EPO作用劑量的上升而逐漸增大,說明EPO處理對葉酸在該方向轉(zhuǎn)運具有促進(jìn)作用；在BL→AP外排方向上,Papp值隨EPO作用劑量的上升而逐漸增大,說明EPO處理對葉酸在該方向轉(zhuǎn)運同樣具有一定促進(jìn)作用。

表2 各時間點葉酸轉(zhuǎn)運的pappTab 2 papp of Ap→BL or BL→Ap at each designed time point(±s)

Papp：Apparent permeability coefficients.

EpO處理對葉酸轉(zhuǎn)運體mRNA表達(dá)水平的影響觀察EPO處理Caco-2細(xì)胞后,內(nèi)葉酸轉(zhuǎn)運體PCFT、RFC和MRP2在m RNA水平的變化(圖2)。EPO處理上調(diào)了PCFT與RFC基因的表達(dá),呈現(xiàn)劑量依賴型(圖2A),但僅中、高劑量EPO所致差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MRP2基因表達(dá)僅在高劑量EPO處理時上調(diào),低、中劑量EPO對MRP2 m RNA水平無明顯影響；在時間依賴性試驗中發(fā)現(xiàn),PCFT與RFC mRNA水平的變化均在48 h時出現(xiàn),且差異有統(tǒng)計學(xué)意義,24 h時出現(xiàn)的上調(diào)結(jié)果的差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。

EpO處理對葉酸轉(zhuǎn)運體蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響觀察EPO處理Caco-2細(xì)胞后,葉酸轉(zhuǎn)運體PCFT、RFC、MRP2蛋白質(zhì)水平的變化(圖3)。EPO處理可劑量依賴性地上調(diào)PCFT、RFC和 MRP2蛋白質(zhì)水平(圖3A),但僅中、高劑量EPO所致差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在時間依賴性試驗中發(fā)現(xiàn), PCFT、RFC和MRP2蛋白質(zhì)水平均在48 h時出現(xiàn)上調(diào),且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。

生理劑量下EpO長期作用對葉酸轉(zhuǎn)運體表達(dá)的影響進(jìn)一步觀察生理劑量下EPO(10 mU/mL)長期作用對葉酸轉(zhuǎn)運體表達(dá)的影響(圖4)。在mRNA水平上(圖4A),96 h作用期間EPO處理組PCFT相對表達(dá)量(實線)及RFC相對表達(dá)量(虛線)與對照組的比值為80%～120%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在蛋白質(zhì)水平上(圖4B),EPO處理組與對照組的PCFT、RFC表達(dá)在5、10及15天時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

葉酸、鐵等微量營養(yǎng)素是造血過程中不可或缺的原料。近年來研究指出,EPO除了在骨髓內(nèi)直接刺激造血細(xì)胞分化外,還具有調(diào)節(jié)鐵吸收的作用,而葉酸的吸收是否也受EPO調(diào)控尚不明確。Caco-2細(xì)胞模型是體外研究營養(yǎng)素吸收的經(jīng)典模型,因此本實驗擬以Caco-2細(xì)胞為模型觀察EPO對葉酸吸收和轉(zhuǎn)運的影響。

在轉(zhuǎn)運實驗中,我們采用AP側(cè)p H 6.0、BL側(cè)p H 7.4的轉(zhuǎn)運環(huán)境,是考慮到人體中腸道p H≈6,而血液p H≈7.4的實際情況。參考文獻(xiàn)選擇EPO的使用劑量［7］,低、中、高劑量分別為0.3、1和3 U/mL,與臨床上治療腎性貧血的實際用量相當(dāng)。從結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn),葉酸在攝取方向和外排方向的轉(zhuǎn)運均受EPO影響。在攝取方向上(AP→BL),EPO處理對葉酸轉(zhuǎn)運具有促進(jìn)作用并呈劑量依賴關(guān)系；在外排方向上(BL→AP),中低劑量EPO對葉酸轉(zhuǎn)運雖無顯著影響,但高劑量EPO處理對葉酸外排同樣具有促進(jìn)作用。因此,我們推測EPO糾正貧血的機制可能與其促進(jìn)葉酸吸收、保證造血原料充足、優(yōu)化造血環(huán)境有關(guān)；同時,高劑量EPO對葉酸轉(zhuǎn)運的雙向調(diào)控作用可能與EPO療法的個體差異性有關(guān)。

腸道內(nèi)負(fù)責(zé)葉酸轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運蛋白主要包括PCFT、RFC和MRP2,其中PCFT與RFC負(fù)責(zé)將葉酸從腸道AP側(cè)轉(zhuǎn)運至BL側(cè)(攝取),而MRP2則負(fù)責(zé)將葉酸從BL側(cè)轉(zhuǎn)運至AP側(cè)(外排)。我們在轉(zhuǎn)運體表達(dá)的檢測中發(fā)現(xiàn),藥理劑量下EPO (0.3、1、3 U/m L)處理48 h即可引起上述轉(zhuǎn)運體表達(dá)的變化。其中,PCFT、RFC表達(dá)在EPO作用下劑量依賴上調(diào),與轉(zhuǎn)運實驗中葉酸在攝取方向的變化一致。值得注意的是,中劑量EPO(1 U/m L)處理與高劑量EPO(3 U/m L)處理引起的PCFT、RFC表達(dá)的變化十分接近,但在轉(zhuǎn)運實驗中兩者引起的變化程度卻有較大差異,說明高劑量EPO (3 U/m L)影響下葉酸攝取的改變可能還有轉(zhuǎn)運體表達(dá)之外的機制參與。MRP2表達(dá)同樣在EPO作用下呈劑量依賴上調(diào),但僅高劑量EPO(3 U/m L)引起葉酸在外排方向的改變,這可能與葉酸外排還有其他轉(zhuǎn)運體參與介導(dǎo)有關(guān)。此外,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運體表達(dá)的變化在m RNA水平與蛋白水平并不完全一致,說明EPO的調(diào)控方式可能同時包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯調(diào)控。

機體在非貧血狀態(tài)下EPO水平含量極低,血中含量約10 m U/m L,但在低氧應(yīng)激中可上升1 000倍,達(dá)到10 U/m L［19-20］。生理劑量下EPO是否與藥理劑量下EPO具有相似功能還值得探討。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),生理劑量下EPO(10 m U/m L)長期作用15天,Caco-2細(xì)胞內(nèi)葉酸轉(zhuǎn)運體PCFT、RFC的表達(dá)無顯著變化。這一現(xiàn)象提示EPO在腸道細(xì)胞上的作用可能是機體在低氧脅迫下的應(yīng)激反應(yīng),即通過促進(jìn)造血原料的吸收、優(yōu)化造血環(huán)境來刺激造血、改善低氧,而在正常情況下該作用處于靜息狀態(tài)。

綜上所述,本研究采用體外培養(yǎng)Caco-2單層細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)了EPO對葉酸腸道吸收的促進(jìn)作用,以及高劑量EPO對葉酸轉(zhuǎn)運的雙向調(diào)控作用,對拓寬EPO作用機制的認(rèn)識,深化了解腎性貧血患者體內(nèi)病理生理的改變具有一定幫助。

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Effects of erythropoietin（Ep O）on the transport of folic acid across Caco-2 monolayers

YAN Jun-kai1,JIN Gui-ying1,RI Ho-nam2,YANG Qing1△
(1Department of Biochemistry,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China；
2Department of Biochemistry,Faculty of Life Science,Kim Il Sung University,Pyongyang,D.P.R.Korea)

Objective To investigate the effect of erythropoietin(EPO)on the transport of folic acid across human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 monolayers.MethodsTransport assays of folic acid in uptake direction and efflux direction were performed in Caco-2 monolayers with or without the supplement of EPO(0.3,1 and 3 U/m L).The effects of EPO on the expressions of folate transportersproton coupled folate transporter(PCFT),reduced folate carrier(RFC)and multidrug resistanceassociated protein 2(MRP2)were analyzed by real time-PCR and Western blot.ResultsTransporter-mediated uptake of folic acid was enhanced by EPO treatment in a dose-dependent manner,and the increasing degrees were 31.6%,61.5%and 120.5%for 0.3,1 and 3 U/m L EPO,respectively.The efflux of folic acid was enhanced only by EPO at high dose(3 U/m L),and the increasing degree was 56.9%.The expression levels of folate transporters(PCFT,RFC and MRP2) were up-regulated by EPO in a dose-and time-dependent manner.ConclusionsEPO at high does bidirectionally regulates the transport of folic acid.The uptake of folic acid was enhanced by EPO in a dose-dependent manner while the efflux of folic acid was enhanced by EPO of high dose.

folic acid； erythropoietin(EPO)； Caco-2 cell； folate transporter

Q 563+.8；Q 735

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.005

2013-03-07；編輯：王蔚)

國家自然科學(xué)基金(30873153)

△Corresponding author E-mail：yangqing68@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(30873153).