松材線蟲內(nèi)寄生菌Esteya vermicola研究進(jìn)展

林 峰，葉兼菱，趙博光

（1.南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210013；3.江蘇南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

松材線蟲內(nèi)寄生菌Esteya vermicola研究進(jìn)展

林 峰1，葉兼菱2，趙博光3*

（1.南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210013；3.江蘇南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

介紹了松材線蟲內(nèi)寄生菌（Esteya vermicola）的發(fā)現(xiàn)、鑒定、分類地位及主要形態(tài)特征，對其與松材線蟲的相互作用進(jìn)行了回顧，并對其在松萎蔫病生物防治中的運(yùn)用前景簡要進(jìn)行了討論。

松材線蟲；Esteya vermicola；內(nèi)寄生菌

松萎蔫病是主要由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）［1］一種松樹毀滅性病害，該病已蔓延到中國、韓國、墨西哥、葡萄牙、西班牙、希臘、葡萄牙、尼日利亞等國家［2－4］。給全球的森林生態(tài)系統(tǒng)造成不可估量的損失［5－6］。由于對其致病機(jī)理尚未研究清楚，因此，目前雖有熏蒸、燃燒、砍伐病木，空中噴灑殺蟲劑，和樹干注射，生物防治等防治措施，但均未能真正拔除疫點或控制疫區(qū)。

真菌對線蟲拮抗活性表現(xiàn)出一系列的特異性和作用方式，極具開發(fā)成為生物殺線蟲劑的潛力［7］。研究表明，松材線蟲的相關(guān)微生物，包括一些食線蟲真菌，食料真菌或細(xì)菌等，均表現(xiàn)出引誘松材線蟲的能力［8－10］。一些食線蟲菌物的培養(yǎng)液和活菌絲對線蟲均有吸引效果。其中，內(nèi)寄生菌物表現(xiàn)出最強(qiáng)的吸引效果，其次是捕食線蟲菌物和非食線蟲菌物［11］。Esteya vermicola是從我國臺灣在世界上首例報道的松材線蟲的內(nèi)寄生真菌［12］。它對松材線蟲具有巨大的生物防治潛能［13］。該真菌與松材線蟲的關(guān)系也作了一些研究［12－20］。Tzean等［15］將其作為一種潛在的防治線蟲的生物防治劑在美國申請了專利。有關(guān)E．vermicola的生物學(xué)，生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，對寄主感染的機(jī)制，以及潛在的作為生物殺線劑的相關(guān)內(nèi)容尚待研究。

1 Esteya vermicola的生物學(xué)特性

Esteya vermicola為至今唯一被報道的可在松樹寄主內(nèi)建立種群的松材線蟲內(nèi)生真菌。屬真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）子囊菌綱（Ascomycetes）肉座菌目（Hypocreales）Ophiostomataceae科埃斯特氏屬唯一的種［12］。

模式種：形態(tài)特征描述如下［21］：在PDA平板上菌落生長速度適中，灰色、灰綠色至暗綠色；背面灰色至暗綠色。菌絲分枝，分隔，無色、近無色至淡灰綠色，光滑、粗糙，直徑2～4 μm。具2型分生孢子梗，產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子。第1型分生孢子梗粗大菌絲狀，單生，直立，基部闊安瓿形，分生孢子梗大小為：［（10）16～29（62）］μm×（3～4.4）μm，梗向頂端漸細(xì)，形成一個極細(xì)的瓶頸，瓶頸直徑為1.5～1.9 μm，近無色至淡綠色，光滑、粗糙至十分粗糙。分生孢子單生，單細(xì)胞。不規(guī)則橢圓形，半月形，向內(nèi)凹陷，末端稍尖，無色壁光滑，（8.2～11.1）μm×（3.5～3.7）μm，分生孢子內(nèi)含類似內(nèi)寄生孢子的結(jié)構(gòu)，分生孢子具粘性。第2型分生孢子梗粗大菌絲狀、單生或分枝，直立，柱狀，分隔，無色、近無色至淡灰綠色，光滑、粗糙至十分粗糙，長（22.2）34.1～43 μm，基部寬3～4.4 μm，頂部直徑1.5 μm。第2型分生孢子單生，單細(xì)胞，桿狀、柱狀，無色，光滑，［（3）4.4～7.4］μm×（1.5～1.9）μm，孢子無粘性，常在瓶頸頂端聚集，以第1型半月狀粘性孢子寄生線蟲。從線蟲體內(nèi)長出的主要是第1型的分生孢子梗和分生孢子。

迄今在全球范圍內(nèi)已報道的E．vermicola有3個菌株。ATCC 74485為模式種，從臺灣被侵染的松材線蟲蟲體上首次分離得到［12］。它的主要特征是具2種不同類型的分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子，第1型分生孢子半月形，第2型分生孢子為桿狀。其中僅以第1型半月形粘性孢子侵染松材線蟲。該真菌對松材線蟲有非常高的侵染率。實驗證明，幾乎100%的供試松材線蟲被該菌株的半月形孢子侵染，并在8～10 d內(nèi)全部被殺死［12］。另1株菌株CBS 115803在捷克斯洛伐克發(fā)現(xiàn)［22］，說明該菌株作為松材線蟲的天敵，可能廣泛分布在全球范圍內(nèi)［13］。隨后，2006年在韓國的1次食線蟲菌物調(diào)查中分離得到1株菌株CNU 120806，被鑒定該菌的新菌株［16］。

Wang等［13］基于28S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)CNU 120806與CBS 115803這2株菌株親緣關(guān)系最近，有著100%的同源性。它們同屬Esteya屬，而E．vermicola是該屬唯一的種。CNU 120806與另外2株已報道的菌株ATCC 74485和CBS 115803具有相似的形態(tài)學(xué)特征及侵染模式，但仍有一些區(qū)別。

此外，E．vermicola還有2株菌株，CBS156.82和CBS100821，由皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心（CBS）于1982和1998年分離得到，地點分別是在日本和意大利。在E．vermicola被命名和詳細(xì)描述之前，這2株菌株一直被命名為其他名字，因此幾乎不為人所知［17］。

2 E．vermicola的寄主和侵染線蟲過程

E．vermicola的寄主主要是線蟲。通過試驗發(fā)現(xiàn)該菌株僅對地上部的植物寄生性線蟲Aphelenchoides besseyi，Aphelenchoidessp.及Bursaphelenchus xylophilus有寄生作用［12－13，16，18，24］。Wang等［13］發(fā)現(xiàn)CNU 120806菌株對腐生線蟲Panagrellus redivivus和植物寄生線蟲B．xylophilus有著很高的侵染率，幾乎100%的供試線蟲在8～10 d內(nèi)死亡。

曾顯雄［23］通過電鏡和光鏡對E．vermicola的侵染過程進(jìn)行了詳細(xì)的觀察和描述，發(fā)現(xiàn)該菌株瓶梗形分生孢子梗上的半月型粘性孢子，具有內(nèi)生孢子，孢子上略為凹陷的1側(cè)具有粘液層，可粘附在經(jīng)過的線蟲體表上。約18 h后孢子萌發(fā)，其內(nèi)生孢子產(chǎn)生侵入釘穿透線蟲體壁，形成節(jié)狀同化菌絲，利用線蟲體內(nèi)營養(yǎng)進(jìn)行營養(yǎng)生長。線蟲被侵染約48 h后，即瀕臨死亡。菌絲突破線蟲體表直接產(chǎn)孢，或形成營養(yǎng)菌絲，向外生長再產(chǎn)生粘性孢子，并可粘著其他線蟲。

3 E．vermicola與松材線蟲關(guān)系的研究

Wang等［13］室內(nèi)實驗證明E．vermicolaCNU 120806對松材線蟲有著非常高的侵染率，幾乎100%的供試線蟲在3～10 d內(nèi)全部被殺死［12－13］，在大棚條件下，還發(fā)現(xiàn)E．vermicola可以有效地降低松萎蔫病病死木中的線蟲蟲口密度，并且在一定程度上控制松萎蔫病，提高松苗的存活率。將E．vermicola與灰葡萄孢的孢子液注入松萎蔫病死木中，結(jié)果表明，與未處理的對照相比，高濃度的E．vermicola孢子液可以降低病木中約79%的線蟲量，而灰葡萄孢則提高了約23%的線蟲量。在大棚條件下，該菌株能夠在4年生的日本赤松（P．densiflora）松苗體內(nèi)定殖并顯著提高松苗的抗病能力。赤松苗表面預(yù)先噴灑高濃度的E．vermicola孢子液，再接種松材線蟲，松苗的存活指數(shù)提高至0.67，而未處理的對照僅為0.06［19］，同時，Wang等［11，17］還證實了CNU120806對松材線蟲有著強(qiáng)烈的吸引作用，吸引效果次之的是捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢（A．Brochopaga）和灰葡萄孢菌（B．cinerea）。E．vermicola的活菌絲對瓊脂平板上的線蟲，已發(fā)病枯萎的松樹木段以及接種線蟲15 d和30 d的松苗里的松材線蟲均有著強(qiáng)烈的吸引效果。同時還發(fā)現(xiàn)活菌絲的氣體揮發(fā)物，對已接種線蟲15 d和30 d的松樹苗里的松材線蟲也有著吸引效果。這對松萎蔫病的生物防治提供了新的實驗依據(jù)。林間研究結(jié)果表明，E．vermicola可以存活在由松樹分泌的樹脂和其他化學(xué)品中，并繁殖新月分生孢子侵染其他松材線蟲。為了確定其致病性，對松苗和大松樹分別接種300 μL和40 mL的該菌株的孢子懸浮液（109／mL）。結(jié)果表明，各處理的松樹是健康的，與對照組比較無差異，此外，木材切片觀察結(jié)果表明，沒有出現(xiàn)由真菌引起壞死或變色［19］。

E．vermicola吸引線蟲的物質(zhì)包括揮發(fā)性物質(zhì)（volatile diffusing compounds）和非揮發(fā)性分泌物（avolatile exudative）。當(dāng)其粘性孢子粘附到線蟲體表時，大多集中在線蟲頭部，也就是許多化學(xué)感受器所在的部位。因此松材線蟲可能對E．vermicola的菌絲和孢子有化學(xué)趨向性，這也是該菌株獲取線蟲作為營養(yǎng)的一種有效的方式［13］。作者［14］試驗證明了E．vermicola分泌揮發(fā)性有機(jī)化合物對松材線蟲具引誘作用，并確定了這些活性化合物為常見的松樹揮發(fā)物：α－蒎烯，β－蒎烯，和樟腦。但非揮發(fā)性分泌物及其生物活性仍待研究。

4 E．vermicola在松萎蔫病生物防治中的應(yīng)用前景

松萎蔫病被認(rèn)為是一個全球性的對松樹林威脅病害，會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和負(fù)面的生態(tài)后果。了解感染過程及所有相關(guān)因素，為制定控制松材線蟲防治策略已成為幾個大洲的共同目標(biāo)［24］。在植物線蟲的生物防治中，捕食線蟲真菌一直被認(rèn)為是有前途的生物制劑［25－28］。

E．vermicola為至今唯一被報道的可在松樹寄主內(nèi)建立種群的松材線蟲內(nèi)生真菌。其新月形分生孢子能黏附松材線蟲的表皮角質(zhì)層，導(dǎo)致感染并使線蟲死亡并從線蟲的尸體內(nèi)長出新的分生孢子，再進(jìn)入下一侵染循環(huán)。目前的研究已經(jīng)證明其作為松萎蔫病生物防治的巨大潛力［12－15，17－20］：（1）該菌株對松材線蟲具高侵染率和致死率；（2）除了幾種線蟲，它不影響其他生物；（3）對寄主松樹是無毒的；（4）特殊形狀的分生孢子易與其他真菌區(qū)分，有利于在松樹體內(nèi)群體的動態(tài)跟蹤；（5）該菌株從自然界中分離，不增加環(huán)境污染。

但是，上述試驗多數(shù)在溫室或運(yùn)用小苗進(jìn)行試驗，林間的推廣將遇到更復(fù)雜的情況，例如風(fēng)、雨、紫外線照射、溫度、濕度等很多因素和其他真菌可能會影響其萌發(fā)與定殖。因此，仍需大量的研究以探明E．vermicola與線蟲，乃至寄主植物的互作機(jī)理。目前，作者［14］報道了其吸引松材線蟲的揮發(fā)性物質(zhì)，并建立了一種簡易、靈敏的“硅膠管”生測方法，為其他揮發(fā)性活性物質(zhì)及非揮發(fā)性物質(zhì)的研究打下了基礎(chǔ)。

［1］ Steiner G，Buhrer E M.Aphelenchoides xylophilusn.sp.，a nematode associated with blue－stain and other fungi in timber［J］. Journal of Agricultural Research，1934（48）：946-951.

［2］ Dwinell L D.First report of pine wood nematodes（Bursaphelenchus xylophilus）in Mexico［J］.Plant Disease，1993（77）：846.

［3］ Mota M M，Braasch H，Bravo M A，et al.First report ofBursaphelenchus xylophilusin Portugal and in Europe［J］.Nematology，1999（1）：727-734.

［4］ Robertson L，Cobacho Arcos S，Escuer M，et al，Incidence of the pinewood nematodeBursaphelenchus xylophilusSteiner＆Buhrer，1934（Nickle，1970）in Spain［J］.Nematology，2011（13）：755-757.

［5］ Mota M，Vieira P.Pine wilt disease：a worldwide threat to forest ecosystems［M］.Dordrecht：Springer，2008：423.

［6］ Vicente C，Espada M，Vieira P，et al.Pine Wilt Disease：a threat to European forestry［J］.European journal of plant pathology，2012（133）：89-99.

［7］ Siddiqui I A，Mahmood I.Biological control of plant parasitic nematodes by fungi：a review.Bioresouse Technology，1996（58）：229-239.

［8］ Balan J，Krizkova L，Nemec P，et al.A qualitative method for detection of nematode attracting substances and proof of production of three different attractants by the fungusMonacrosporium rutgeriensis［J］.Nematology，1976（22）：306-311.

［9］ Field J J，Webster J.Traps of predacious fungi attract nematodes. Transactions of the British Mycological Society，1977（68）：467-469.

［10］Jansson H，Nordbring－h(huán)ertz B.Attraction of nematodes to living mycelium of nematophagous fungi［J］.Journal of General Microbiology，1979（112）：89-94.

［11］Wang C，Y，Wang Z，F(xiàn)ang Z M，et al.Attraction of pinewood nematode to endoparasitic nematophagous fungusEsteya vermicola［J］.Current Microbiology，2010（60）：387-392.

［12］Liou J Y，Shih J Y，Tzean S S.Esteya，a new nematophagous genus from Taiwan，attacking the pinewood nematode（Bursaphelenchus xylophilus）［J］.Mycrobiological Research，1999（103）：242-248.

［13］Wang C Y，F(xiàn)ang Z M，Sun B S，et al.High infectivity of an endoparasitic fungus strain，Esteya vermicola，against nematodes［J］.Journal of Microbiology，2008（46）：380-389.

［14］Lin F，Ye J L，Wang H G，et al.Host deception：predaceousfungus，Esteya vermicola，entices pinewood nematode by mimicking the scent of pine tree for nutrition［J］.Plos one，2013（8）：e71676.

［15］Tzean S S，Liou J Y，Shih J Y.Nematophagous fungusEsteya vermicola［P］.United States Patent，US 006168947B1，2001.

［16］Wang C Y，Mo M H，Li X，et al.Morphological characteristics and infection processes of nematophagousHarpo－poriumwith reference to two new species［J］.Fungal Diversity，2007（26）：287-304.

［17］Wang C Y，F(xiàn)ang Z M，Wang Z，et al.High infection activities of twoEsteya vermicolaisolates against pinewood nematode［J］.African Journal of Microbiology Research，2009（3）：581-584.

［18］Wang C Y，F(xiàn)ang Z M，Wang Z，et al.Biological control of the pinewood nematodeBursaphelenchus xylophilusby application of the endoparasitic fungusEsteya vermicola［J］.Biocontrol（dordrecht），2011（56）：91-100.

［19］Wang Z，Wang C Y，Yang Z H，et al.Viability and pathogenicity ofEsteya vermicolain pine trees［J］.Biocontrol Science and Technology，2011（21）：387-393.

［20］Wang Z，Wang C Y.，Gu L J，et al.Growth ofEsteya vermicolain media amended with nitrogen sources yields conidia with increased predacity and resistance to environmental stress［J］.Canadian Journal of Microbiology，2011，57（10）：838-843.

［21］李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲菌物分類學(xué)［M］.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，2000：248.

［22］Kubátová A，Novotny D，Práil K，et al.The nematophagous hyphomyceteEsteya vermicolafound in the Czech Republic［J］. Czech Mycology，2000（52）：227-235.

［23］曾顯雄.松材線蟲新內(nèi)部寄生菌esteya vermicola之病原學(xué)，生理學(xué)及微細(xì)構(gòu)造之探討（3／3）［D］.臺北：國立臺灣大學(xué)植物病理與微生物學(xué)系暨研究所，2002：1-21.

［24］Jones JT，Moens M，Mota M，et al.Bursaphelenchus Xylophilus：opportunities in comparative genomics and molecular host－parasite interactions［J］.Molecular Plant Pathology，2008（9）：357-368.

［25］Assis R C，Luns F D，Araujo J V，et al.Biological control of trichostrongyles in beef cattle by the nematophagous fungusDuddingtonia flagransin tropical southeastern Brazil［J］.Experimental Parasitology，2012（132）：373-377.

［26］Gomes A P，Araujo J V，Ribeiro R C.Differential in vitro pathogenicity of predatory fungi of the genusMonacrosporiumfor phytonematodes，free－living nematodes and parasitic nematodes of cattle［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，1999（32）：79-83.

［27］Gronvold J，Wolstrup J，Nansen P，et al.Biological control of nematode parasites in cattle with nematode－trapping fungi：a survey of Danish studies［J］.Veterinary Parasitology，1993（48）：311-325.

［28］Gronvold J，Wolstrup J，Nansen P，et al.Nematode－trapping fungi against parasitic cattle nematodes［J］.Parasitology Today，1993（9）：137-140.

Review on the endoparasitic fungus Esteya vermicola

LIN Feng1，YE Jian-ling2，ZHAO Bo-guang3*
（1.Advanced Analysis and Testing Center，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；2.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210013，China；3.College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

We introduced the discovery，identification，classification and main morphological characteristics of pine wood nematode（PWN）endoparasitic fungus（Esteya vermicola）in this paper，the interaction betweenEstega vermicolaand PWN was briefly discussed，its application in biological control in pine wilt disease was reviewed.

Bursaphelenchus xylophilus；Esteya vermicola；Endoparasitic fungus

S763

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.02.013

1001－7380（2014）02－0050－04

2014-02-11；

2014-02-21

林 峰（1979－），女，福建莆田人，實驗員，主要研究方向：松萎蔫病致病機(jī)理的研究。

*通信作者：趙博光（1944－），男，教授，碩士，主要從事森林保護(hù)學(xué)的研究與教學(xué)工作，E-mail：zhbg＠nifu.edu.cn。