結(jié)直腸癌病人腸道黏膜菌群結(jié)構(gòu)的變化

李毅，王驥平，李宇，曹守根，姚增武，周巖冰

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，山東 青島 266003； 2 青島市市立醫(yī)院東院急診外科； 3 煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院)

人體胃腸道蘊(yùn)藏著一個(gè)復(fù)雜而豐富的微生物群落，在結(jié)腸中含有高達(dá)1013～1014的微生物[1]。這些微生物對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)和黏膜免疫方面有至關(guān)重要的作用，如代謝某些食物和藥物成分、調(diào)節(jié)人體免疫應(yīng)答、抵御外來(lái)病源侵害，等等[2-3]。已知胃癌和宮頸癌分別由幽門(mén)螺旋桿菌和人類乳頭狀瘤病毒所導(dǎo)致[4-5]。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多研究顯示，腸道菌群在結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展中起到重要作用[6]。本研究采用第二代高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)，分析 CRC病人腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，探討CRC診斷與治療的新方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院住院的CRC病人50例，男25例，女25例；年齡41～80歲；體質(zhì)量指數(shù)19.7～28.6。病人既往無(wú)結(jié)直腸手術(shù)史；無(wú)慢性腸道疾病、代謝性疾病、感染性疾??；術(shù)前未行放化療治療；手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗生素以及其他的非甾體抗炎藥物。手術(shù)標(biāo)本在進(jìn)行病理組織學(xué)檢查后按TNM分期進(jìn)行分類。癌組織和癌旁正常組織(距癌組織8～10 cm)在手術(shù)期間收集。所有標(biāo)本立即用液氮快速冰凍然后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱內(nèi)。病人均知情同意。

1.2 細(xì)菌DNA提取

糞便細(xì)菌基因組DNA通過(guò)DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn))進(jìn)行提取。將樣品中加入酶裂解緩沖液、溶菌酶和消色肽酶，并在37 ℃下反應(yīng)1 h。然后，加入蛋白酶K和裂解緩沖液AL，并將懸浮液置于56 ℃下反應(yīng)30 min。最后，將基因組DNA通過(guò)核酸純化柱進(jìn)行純化并洗脫。所提取的基因組DNA的濃度通過(guò)量子比特?zé)晒庥?jì)(美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn))測(cè)定，DNA的質(zhì)量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定。提取的基因組DNA儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。DNA提取均由中國(guó)深圳華大基因研究院專業(yè)人士完成。

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

使用通用引物(907F5′-CCGTCAATTCMTTT-GAGTTT-3′，338R5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)進(jìn)行細(xì)菌的16S rDNA序列的V3-V5區(qū)域的PCR擴(kuò)增。參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性2 min；然后95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。焦磷酸測(cè)序使用GS FLX Titanium XLR70測(cè)序試劑盒，在454高通量測(cè)序平臺(tái)(羅氏)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由中國(guó)深圳華大基因研究院完成。

1.4 生物學(xué)分析

首先將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行非冗余處理，然后將非冗余的序列進(jìn)行物種注釋并聚類成操作分類單元(OTU)，然后通過(guò)OTU注釋完成物種的分類。使用Mothur(V.1.31.2，http://www.mothur.org/)軟件將樣品獨(dú)特序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mothur.org/wiki/RDP_reference_files)比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，一個(gè)OTU中包含的獨(dú)特序列51%以上都注釋為同一物種，則該OTU即注釋為該物種，達(dá)不到51%的標(biāo)準(zhǔn)，則在上一個(gè)物種分類等級(jí)再進(jìn)行OTU對(duì)應(yīng)物種分析，得到該樣品的物種組成信息，然后將每個(gè)OTU內(nèi)所含的獨(dú)特序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)合物種組成信息結(jié)果，得到每個(gè)物種在該樣品中的豐度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。兩組樣本數(shù)據(jù)間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 序列多樣性分析

本文100個(gè)樣本共得到1 032 723條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本含10 327條序列；在97%相似度水平上共得到12 115個(gè)OUT，平均每個(gè)樣本含121個(gè)OUT。在當(dāng)前測(cè)序深度下，稀疏曲線和Shannon指數(shù)幾乎趨于穩(wěn)定，表明大部分物種和多樣性已經(jīng)被檢測(cè)到。

2.2 兩種組織菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上的比較

癌組織和癌旁正常組織中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相同，均為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和放線菌門(mén)。在CRC的癌組織中，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和放線菌門(mén)分別占35.34%、33.84%、14.79%、13.62%和0.94%；在癌旁正常組織中分別占37.53%、39.96%、15.27%、2.30%和2.51%。癌組織中梭桿菌門(mén)明顯高于癌旁正常組織(Z=3.63，P<0.001)。

2.3 兩種組織菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上的比較

在屬水平上，測(cè)序結(jié)果顯示癌組織有172個(gè)屬，癌旁正常組織有159個(gè)屬，擬桿菌屬在兩組中均為豐度最高的菌屬，分別占22.38%和21.25%，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。存在顯著性差異的菌屬為梭桿菌屬、彎曲菌屬、Faecalibacterium和羅氏菌屬，在癌組織中分別占12.08%、0.02%、1.94%和0.46%；在癌旁正常組織中分別占1.96%、0.01%、6.14%和2.42%。梭桿菌屬、彎曲菌屬在癌組織中的豐度與癌旁正常組織相比明顯降低，而Faecalibacterium、羅氏菌屬豐度明顯升高，差異有顯著意義(Z=1.84～3.63,P<0.05)。

3 討 論

腸道菌群對(duì)于維持宿主腸道乃至全身的正常代謝功能和健康狀態(tài)具有非常重要的意義[7-8]。本研究應(yīng)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了CRC病人癌組織和癌旁正常組織菌群結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示，癌組織菌群結(jié)構(gòu)較周圍正常組織發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了有害的條件致病菌增加、有益的細(xì)菌減少的結(jié)構(gòu)失調(diào)現(xiàn)象。

腸道炎癥一直被稱為腸癌的危險(xiǎn)因素[9]。而在本項(xiàng)研究中梭桿菌屬和彎曲菌屬在癌組織中明顯增多。梭桿菌屬是一種具有侵入性和促炎的革蘭陰性厭氧菌，而大量研究也表明，梭桿菌參與了炎癥性腸疾病的發(fā)展[10]；彎曲菌屬中被研究最多的是空腸彎曲菌，是目前公認(rèn)的急性腹瀉和胃腸炎的主要病原菌[11]。因此，梭桿菌屬和彎曲菌屬可能通過(guò)引起腸道炎癥導(dǎo)致腸道微環(huán)境發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，但其促癌的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

Faecalibacterium和羅氏菌屬均為丁酸產(chǎn)生菌，通常被認(rèn)為是益生菌微生物[12]。因?yàn)槎∷猁}可以通過(guò)保護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性、調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、降低促致癌酶的活性等機(jī)制，從而能夠保護(hù)宿主腸壁，降低腸道炎癥及CRC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]。因此，這些有益細(xì)菌的減少可能是導(dǎo)致CRC發(fā)生的間接原因。

綜上所述，本研究通過(guò)焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究了CRC病人腸道菌群的相關(guān)變化，結(jié)果出現(xiàn)了有害的條件致病菌增加、有益細(xì)菌減少的結(jié)構(gòu)失調(diào)現(xiàn)象，這為CRC的診斷和治療提供了新思路。然而，腸道菌群變化促癌的確切機(jī)制仍不清楚，因此需要更多的研究以探討CRC發(fā)生腸道菌群失調(diào)的機(jī)制。

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