死亡時(shí)間推斷方法的研究進(jìn)展

虢洪松綜述 崔 文 審校

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 山東 濟(jì)寧272067)

死亡時(shí)間(time of death)在法醫(yī)學(xué)上是指機(jī)體死后經(jīng)過時(shí)間或死后時(shí)間間隔(postmortem interval,PMI)，即檢驗(yàn)尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。死亡時(shí)間推斷即推斷死后經(jīng)歷或間隔時(shí)間，是法醫(yī)學(xué)鑒定中需要解決的重要問題之一。傳統(tǒng)方法是根據(jù)尸體變化(超生反應(yīng)、尸溫、尸斑等)、尸體昆蟲等[1-3]來進(jìn)行PMI推斷,但易受到外界環(huán)境因素的影響,準(zhǔn)確性不高。近年來,中外法醫(yī)學(xué)者提出了許多新的研究方法及技術(shù)，本文就其中的傅立葉變換紅外光譜技術(shù)(Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR)、彗星試驗(yàn)、顯微分光光度術(shù),在死亡時(shí)間推斷研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 FTIR

FTIR主要由紅外光源經(jīng)準(zhǔn)直后變成平行光出射，由探測器測量得到干涉圖，經(jīng)快速傅里葉變換后能迅速識別并分析出該能量所對應(yīng)的物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及含量。具有掃描速度快，分辨率高且不對組織損毀和產(chǎn)生化學(xué)變化等[4]優(yōu)點(diǎn)，大量應(yīng)用于組織細(xì)胞等復(fù)雜體系的研究。因此,FTIR可作為一種實(shí)用的技術(shù)用于死亡時(shí)間的推斷。

黃平等[5]應(yīng)用FTIR分析大鼠死后組織、人體離體組織隨死亡時(shí)間推移的化學(xué)降解過程實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明，人體心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟皮質(zhì)、骨骼肌、大腦皮質(zhì)和大鼠光譜變化相似。隨著時(shí)間的變化,大鼠組織、人離體組織的FTIR光譜主要吸收峰沒有明顯變化,但其峰強(qiáng)隨著死亡時(shí)間增加呈現(xiàn)出3種不同的變化方式：增加、下降、穩(wěn)定，且不同峰強(qiáng)比顯示出了相似的時(shí)間變化趨勢。大鼠肝組織、腎皮質(zhì)、脾組織的峰強(qiáng)和峰強(qiáng)比變化比骨骼肌、心臟、肺臟的變化更為明顯。在20℃下，死后24h內(nèi)可觀察到大鼠脾組織和腎皮質(zhì)吸收峰變化，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在24h后才能觀察到心臟、肺臟、骨峰強(qiáng)比的變化。故可認(rèn)為脾組織和腎皮質(zhì)適合早期PMI推斷，心臟、肺組織、骨骼肌可用于晚期PMI推斷。同樣有研究表明[6]，脾和腎皮質(zhì)光譜可以有效進(jìn)行24h內(nèi)早期PMI推斷。另有學(xué)者[7-8]在20℃外界條件下，以心臟、肝組織、脾臟、肺組織、腎皮質(zhì)、骨骼肌作為樣本，觀察死后FTIR光譜吸收峰在大鼠組織和人離體組織的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1238、1080、1396cm-1吸收峰下，大鼠在死后24h內(nèi)其心臟、肺組織、骨骼肌可以觀察到不同變化，但其他吸收峰在相鄰死亡時(shí)間點(diǎn)變化很小，無法區(qū)分。在死后,大鼠的脾臟和腎組織自溶發(fā)生早、速度快，24h后脾臟和腎皮質(zhì)吸收峰峰強(qiáng)及峰強(qiáng)比差別明顯，72h后便可見組織液化發(fā)生，168h后組織固體成分無法提取，但在死后120h，可觀察到脾和腎皮質(zhì)吸收峰峰強(qiáng)平臺期變化趨勢緩慢，相鄰死亡時(shí)間點(diǎn)不能區(qū)分，考慮可能是在死后晚期這些組織已處于完全溶解狀態(tài)[9]。而心臟和骨骼肌組織在死后168h保持固體狀態(tài)，故在死亡晚期，大鼠的心臟、肺組織、骨骼肌FTIR光譜下降趨勢要比脾臟和腎組織明顯，可考慮這3個(gè)器官進(jìn)行晚期PMI推斷[10]。雖然FTIR光譜可以檢測不同組織及器官在死亡早期和晚期光譜學(xué)的變化,但由于離體組織和在體組織的客觀環(huán)境條件存在很大差異，是否具有相似的擬合曲線方程及光譜的規(guī)律性變化，尚需進(jìn)一步研究探討。因此,在建立使用FTIR推斷PMI的數(shù)據(jù)庫時(shí)，不能僅用離體器官組織的樣本數(shù)據(jù)，而應(yīng)收集不同犯罪現(xiàn)場、不同死因及不同周圍環(huán)境條件下的在體樣本信息，這將是FTIR推斷PMI的數(shù)據(jù)庫建立的基礎(chǔ)措施。

2 彗星試驗(yàn)

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(singlecell gel electrophoresis,SCGE),是Ostling等于1984年首次提出，由于細(xì)胞電泳形狀與彗星頗似，又稱彗星試驗(yàn)(comet assay)。它能直接檢測并分析死后機(jī)體組織細(xì)胞DNA的降解情況。在堿性條件電泳后，已發(fā)生降解的細(xì)胞則形成彗星樣的尾部，而未降解的DNA細(xì)胞呈無尾圓形熒光核心，即彗星頭部。隨著時(shí)間的延長DNA降解增多,彗星頭逐漸變小,彗星尾逐漸增長。故通過測定“彗星樣”細(xì)胞出現(xiàn)率(計(jì)數(shù)一定量細(xì)胞其中彗星樣細(xì)胞所占的比例)、頭半徑、頭面積、尾長度、尾矩、尾面積、頭/尾DNA含量比例、Oliver矩等參數(shù),可監(jiān)測細(xì)胞核 DNA 降解變化趨勢，對DNA降解程度進(jìn)行定量分析[11]。

易少華等[12]用彗星試驗(yàn)檢測大鼠死后脾細(xì)胞DNA降解變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，彗星頭和尾DNA含量、尾長度、尾面積、Oliver矩等參數(shù)與PMI呈線性相關(guān)關(guān)系。安妮等[13]在應(yīng)用彗星試驗(yàn)對兔骨髓細(xì)胞核DNA降解變化的研究中，借助專業(yè)的計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)軟件，對不同部位及不同死亡時(shí)間內(nèi)骨髓有核細(xì)胞DNA降解進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，處于不同部位骨髓有核細(xì)胞核DNA隨死亡時(shí)間發(fā)生的不同程度的降解，其降解程度與死亡時(shí)間之間呈相關(guān)性。鄭吉龍等[14]應(yīng)用彗星試驗(yàn)研究小鼠器官細(xì)胞核中DNA降解變化與死亡時(shí)間的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中，測定小鼠在死后72h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌、心、肝、腎、腦細(xì)胞核內(nèi)頭DNA含量、頭半徑、尾DNA含量、尾長度、尾矩、Olive 矩、尾面積等8項(xiàng)參數(shù)的變化值。結(jié)果，在小鼠死亡72h內(nèi),彗星尾DNA含量、尾長度、尾矩、尾面積、Olive 矩都呈增加趨勢,頭DNA含量、頭半徑、頭面積均呈下降趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，死后核DNA降解速率與組織來源有關(guān)，其中腦組織最早發(fā)生降解，然后依次為肝、腎、心和骨骼肌組織。同時(shí)對以上8個(gè)測量參數(shù)綜合分析，發(fā)現(xiàn)肝組織與死后間隔時(shí)間的相關(guān)性較強(qiáng)，各參數(shù)近似呈直線相關(guān)，在回歸分析中相關(guān)系數(shù)較高，因此，在應(yīng)用DNA降解分析來推斷PMI中，肝組織是較理想的器官。另外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在同一條件下，同一參數(shù)的測量值在同一樣本不同細(xì)胞之間具有差異，這表明，在相同組織內(nèi)DNA降解程度在不同細(xì)胞之間也具有差異性，考慮可能與細(xì)胞之間環(huán)境細(xì)微差別有關(guān)。李曉娜等[15]在應(yīng)用彗星試驗(yàn)研究兔牙髓細(xì)胞核DNA降解的實(shí)驗(yàn)中，通過對上述參數(shù)指標(biāo)測定，也得出與鄭吉龍等相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)并將每個(gè)參數(shù)的測量值進(jìn)行了多項(xiàng)式運(yùn)算，獲得了更能體現(xiàn)DNA降解趨勢的二項(xiàng)式回歸方程,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。明紹利等[16]應(yīng)用彗星試驗(yàn)研究在牙齒離體后72h內(nèi)，牙髓細(xì)胞核DNA降解規(guī)律，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牙髓細(xì)胞核DNA彗星電泳的多個(gè)彗星參數(shù)(彗星頭DNA、尾DNA、Olive尾矩等)與PMI之間呈線性關(guān)系。應(yīng)用彗星試驗(yàn)推斷PMI具有以下優(yōu)勢[17]：1)簡捷迅速，從采樣到結(jié)果分析的過程時(shí)間短,為現(xiàn)場勘察和大樣本量分析提供了可能；2)靈敏度高,能有效測定每1.657×10-1kg中0.1個(gè)DNA的斷裂；3)需要量少,每份樣品一般只需1000個(gè)細(xì)胞；4)安全性高,無需放射性標(biāo)記。因此，彗星試驗(yàn)將會(huì)成為推斷死亡時(shí)間精確、客觀的新方法。

3 顯微分光光度測定技術(shù)

顯微分光光度測定技術(shù)(microspectrophotometry)是根據(jù)某些物質(zhì)分子對光波進(jìn)行選擇性吸收的原理，在顯微鏡下對樣品中的微細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行測定的技術(shù)，因“顯微鏡”具有使樣品圖像放大，提高靈敏度的部分作用，故被分析的樣品量可以非常低，能精確測定樣本中的一個(gè)細(xì)胞,甚至核仁內(nèi)的核酸、酶和其他極微量物質(zhì)的含量。其中常用的測量方法有掃描測量法、單波長法、熒光光度法。目前,由于熒光光度法在測定細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、氨基酸和生物胺的相對含量中具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于PMI推斷的研究中[18]。2000年,Hiroshi Ikegaya[19]在對死后0～4d內(nèi)大鼠的腦、肝、心、腎等器官中細(xì)胞色素c氧化酶(COX)的活性進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)COX活性的變化趨勢與大鼠死亡時(shí)間呈相關(guān)性,其中COX在心、腦、腎中的活性相似,而遠(yuǎn)高于肝、肺組織,這與Anthony G等[20]及Rohdich F等[21]的研究結(jié)果相一致。因此,不同器官組織中的COX的活性高低可作為死亡時(shí)間推斷參考指標(biāo)。2008年,李偉等[22]通過測定不同死亡時(shí)間大鼠右心內(nèi)血漿吸光度的變化趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿的吸光度與死亡時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.01)。2009年,劉茜等[23]同樣采用生物熒光發(fā)光法測定大鼠死后肌肉組織中微生物ATP含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物ATP的含量與死亡時(shí)間之間呈正相關(guān),因而成為一個(gè)推斷晚期PMI的參數(shù),但受嗜尸性昆蟲等外界不確定因素的影響準(zhǔn)確性不高。2009年,日本學(xué)者Yosuke等[24]在應(yīng)用顯微分光光度術(shù)對死后72h內(nèi)的21例尸體皮膚顏色研究觀察中，發(fā)現(xiàn)其中31個(gè)顏色參數(shù)指標(biāo)變化趨勢與死亡時(shí)間呈相關(guān)性。另有學(xué)者[25]過顯微分光光度術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，死后72h內(nèi)尸斑變化(色度、色澤等指標(biāo))與死亡時(shí)間具有相關(guān)性，這為早期PMI的推斷提供了新思路。

4 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞高速準(zhǔn)確定量分析和分選技術(shù)。通過測定RNA、DNA及細(xì)胞體積等參數(shù),對細(xì)胞進(jìn)行高純度的分類。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。后來,DiNunnoticedN[26-27]、王慧君[28]應(yīng)用FCM技術(shù)定量對死亡機(jī)體所具有的不完整DNA的細(xì)胞數(shù)目檢測,并與完整DNA的細(xì)胞數(shù)目相比較,結(jié)果證實(shí)，隨著死亡時(shí)間的延長，兩者的百分比例升高,可作為PMI推斷的依據(jù)。2003年,Valet G等[29]應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合圖像分析系統(tǒng)，提高了細(xì)胞DNA含量測定的精確性,促進(jìn)了應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行PMI推斷的發(fā)展。張伯旸等[30]應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定肝組織中含不完整DNA的細(xì)胞數(shù)所占百分比,來研究人體死后肝臟細(xì)胞DNA含量變化與死亡時(shí)間的關(guān)系及影響因素實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明，隨死亡時(shí)間的延長DNA含量逐漸增高,與死亡時(shí)間之間具有相關(guān)性。在兩種高、低不同環(huán)境溫度條件下,死后24～72h內(nèi)人肝細(xì)胞DNA含量隨死亡時(shí)間的延長逐漸增高,與死亡時(shí)間之間具有相關(guān)性。這與齊鳳英等[31]應(yīng)用FCM技術(shù)對死后不同時(shí)間大鼠的心、腎、肝等組織的DNA含量變化以及Cina[32]對死后人脾組織細(xì)胞DNA含量變化的研究結(jié)論相一致。然而,在使用流式細(xì)胞技術(shù)時(shí),需將制作成單細(xì)胞懸液,單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10000個(gè)，并且只對完整的細(xì)胞分析,因此在死亡時(shí)間推斷中的具有一定的局限性。

5 小結(jié)

PMI的推斷歷來是法醫(yī)病理學(xué)研究的熱點(diǎn)問題，盡管國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者提出了許多研究方法或?qū)W說，如根據(jù)超生反應(yīng)檢測、離子檢測、酶檢測、DNA降解程度檢測等推斷死亡時(shí)間，但這些方法在實(shí)際工作中的應(yīng)用尚有較大距離，問題仍然沒有很好地解決。需要我們繼續(xù)深入研究。但是，僅靠某一指標(biāo)進(jìn)行死亡時(shí)間推斷，其準(zhǔn)確性不高且難以廣泛應(yīng)用。因此,應(yīng)不斷拓寬研究范圍，綜合多種影響因素的多參數(shù)綜合推斷死亡時(shí)間，提高其準(zhǔn)確性[35]。

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