卵巢功能早衰中端粒及端粒酶作用的研究進(jìn)展

王偉聿，唐 莉，2*

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500;2.云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，云南昆明650032)

卵巢在女性的一生中扮演了重要的角色，不僅為卵泡提供發(fā)育的場(chǎng)所，還有分泌性激素的重要功能。隨著年齡增長，卵巢的功能開始緩慢衰退，生殖器官也開始衰老萎縮，而其他器官也隨之出現(xiàn)相應(yīng)變化。停經(jīng)作為卵巢衰老的重要標(biāo)志，由卵泡耗竭造成。正常人的停經(jīng)受環(huán)境和遺傳等多因素共同影響。以最后一次月經(jīng)發(fā)生的年齡為標(biāo)準(zhǔn)，停經(jīng)平均發(fā)生于50.7歲。卵泡內(nèi)卵細(xì)胞的分裂成熟、顆粒細(xì)胞的增殖分化凋亡在體內(nèi)卵泡維持中起到了相當(dāng)重要的作用，因此卵巢細(xì)胞的增殖能力對(duì)于卵巢產(chǎn)生和釋放生殖細(xì)胞、分泌激素的功能至關(guān)重要。而端粒和端粒酶參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，作者推測(cè)端粒和端粒酶參與了卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)致病機(jī)制。

1 卵巢功能早衰

POF是指婦女在40歲之前出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)，伴隨有促性腺激素(gonadotro-phin，Gn)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高，雌激素(oestrogen)水平降低等諸多臨床表現(xiàn)［1］。除了閉經(jīng)外，患者還會(huì)出現(xiàn)雌激素缺乏所致的泌尿生殖道癥狀和不孕等癥狀。POF的診斷標(biāo)準(zhǔn)為婦女40歲之前在至少4個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)了3次閉經(jīng)，并且性激素降低，血清FSH水平在兩個(gè)月內(nèi)兩次超過40 IU/L［2］。POF發(fā)生率逐年升高，并且開始低齡化，40歲以下的婦女中患病率接近1%，20～30歲的婦女中為0.1%，20歲以下婦女中為0.01%。

2 卵巢功能早衰的病因

POF的致病原因有很多，包括了染色體缺陷、基因遺傳、自體免疫等，但仍有50% ～60%的患者仍找不到確切病因［3-4］。

POF有一定遺傳性。約有12%～50%的POF患者有家族病史。通常認(rèn)為POF和早停經(jīng)都屬于常染色體或X連鎖顯性遺傳?。?］。目前POF尚無公認(rèn)標(biāo)記基因，但X染色體對(duì)于卵巢功能至關(guān)重要，Xp終端缺失可表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)或早停經(jīng)，Xq終端缺失則引起POF。女性X染色體缺失導(dǎo)致特納綜合征(turner syndrome，Ts)。而其他定位于X染色體上的基因也能影響卵巢功能。成骨蛋白15(bone mophogenetic protein 15，BMP-15)的突變會(huì)影響早期卵泡生成。而FMR1(fragile X mental retardation 1)突變所致的脆性X綜合征患者中POF發(fā)生率比常人高3倍。除外，一些常染色體基因突變也會(huì)導(dǎo)致POF的發(fā)生。如半乳糖-1磷酸酶尿苷轉(zhuǎn)移酶基因(GALT)、FOXL2和EIF2B的突變都與POF 有關(guān)［6-7］。

約有30%的POF和自身免疫機(jī)制有關(guān)。少數(shù)胸腺缺陷的女性出現(xiàn)卵巢萎縮和卵泡缺失的癥狀。臨床診斷發(fā)現(xiàn)5%～30%的POF患者同時(shí)患有免疫性疾病，如橋本甲狀腺炎和阿狄森氏綜合征。因此POF也有可能是這類免疫疾病的并發(fā)癥。

外界因素也有可能導(dǎo)致POF。盆腔手術(shù)可能引起局部炎性反應(yīng)而損傷卵巢，環(huán)磷酰胺會(huì)抑制顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，殺蟲劑及重金屬會(huì)破壞卵泡而導(dǎo)致POF。

3 端粒和端粒酶的功能

端粒最早在四膜蟲細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，作用在于彌補(bǔ)DNA不完全半保留復(fù)制中引物降解所致的DNA單鏈序列損耗，保持染色體的完整性，限制細(xì)胞的分裂次數(shù)。人體不同組織細(xì)胞內(nèi)端粒長度不同，主要受端粒酶、端粒結(jié)合蛋白、核糖基轉(zhuǎn)移酶-核糖多聚酶等共同調(diào)控。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)端粒總長度約5～15 kb，精子和早期胚胎細(xì)胞端粒長度可達(dá)15～20 kb。隨著細(xì)胞分裂染色體末端會(huì)丟失部分序列，每次分裂后染色體末端約失去50～200 bp，而在細(xì)胞一生中端粒共縮短大約2～15 kb［8］。端粒過短是細(xì)胞衰老的特征之一。過短端粒能夠通過直接或者間接的方式激活P53，細(xì)胞進(jìn)入衰老和凋亡過程［9］。

端粒在細(xì)胞衰老中發(fā)揮了重要作用，而其調(diào)控與端粒酶密切相關(guān)。端粒的完整復(fù)制依賴于端粒酶活性［10］。端粒主要有延長端粒，維持染色體穩(wěn)定以及修復(fù)受損染色體末端等功能。

端粒酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，能夠以自身的RNA為模板合成端粒DNA。人類的端粒酶包括3個(gè)部分:1)端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR);2)端粒酶相關(guān)蛋白1(telomerase associated-protein 1，TP1/TLP1);3)端粒酶催化亞單位(human telomerase catalytic subunit，hTERT/hTRT)。正常體細(xì)胞中往往存在hTR，卻沒有端粒酶活性。但模板區(qū)對(duì)于端粒酶結(jié)合DNA及其反轉(zhuǎn)錄酶活性是必需的。此外，hTR的模板序列突變也會(huì)影響端粒的穩(wěn)定性［11］。hTERT基因是單拷貝基因，在胚胎和腫瘤中都有較強(qiáng)的表達(dá)，其表達(dá)量與端粒酶活性正相關(guān)。

總之，端粒和端粒酶通過多個(gè)途徑參與了人體的發(fā)育、生殖、衰老和疾病發(fā)生等多個(gè)環(huán)節(jié)多水平復(fù)雜調(diào)控，其中涉及了多個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄前，翻譯，翻譯后多個(gè)水平的調(diào)控，包括端粒結(jié)合蛋白、細(xì)胞周期蛋白及相關(guān)細(xì)胞因子、相關(guān)蛋白的磷酸化和去磷酸化等多個(gè)方面。

4 端粒/端粒酶與卵巢功能早衰的關(guān)系

女性的生殖壽命由出生時(shí)卵巢內(nèi)的卵泡決定。正常卵巢衰老取決于原始卵泡消耗速率。而卵泡數(shù)是卵泡補(bǔ)充、維持和消耗相平衡的結(jié)果［12］。卵巢內(nèi)細(xì)胞增殖在卵泡補(bǔ)充和維持過程中起到了主要作用，同顆粒細(xì)胞增殖分化和隨后的衰老凋亡共同促進(jìn)了卵細(xì)胞分裂成熟和性激素的產(chǎn)生。一些POF患者卵巢細(xì)胞內(nèi)的端粒短于正常人［13］。而在卵巢中，顆粒細(xì)胞的增殖發(fā)育以及卵母細(xì)胞的成熟都同端粒密切相關(guān)。

卵泡發(fā)育時(shí)，顆粒細(xì)胞大量增殖分化，而端粒的長度影響顆粒細(xì)胞的增殖能力。端粒過短導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的增殖速度減慢，分泌的雌激素不能滿足需要，造成卵泡的發(fā)育滯后，因此才會(huì)出現(xiàn)停經(jīng)、雌激素水平降低等癥狀。在患有隱匿型卵巢功能不全患者體內(nèi)，顆粒細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性以及端粒長度都出現(xiàn)了異常［14］，證實(shí)POF與顆粒細(xì)胞內(nèi)端粒酶失活有關(guān)。卵丘細(xì)胞由顆粒細(xì)胞分化而來，研究發(fā)現(xiàn)其端粒長度和胚胎質(zhì)量有關(guān)，卵丘細(xì)胞端粒較長則卵細(xì)胞質(zhì)量更好［15］。

端粒的長度還會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。女性生殖衰老的端粒理論指出在女性衰老過程中卵細(xì)胞出現(xiàn)了包括減數(shù)分裂染色體不分離、胚胎停滯、凋亡和流產(chǎn)在內(nèi)的功能紊亂［16］。而這都源自兩次“打擊”:卵原細(xì)胞生成時(shí)染色體交叉減少和排卵間隔期間的活性氧損傷。而細(xì)胞分裂時(shí)染色體交叉減少同細(xì)胞內(nèi)的端粒過短有直接關(guān)系。端粒DNA缺失的卵母細(xì)胞更易發(fā)生染色體非整倍性。端粒縮短時(shí)細(xì)胞第1次減數(shù)分裂(meiosis I，MI)染色體之間的交叉和聯(lián)會(huì)也減少。而這樣的缺陷有可能導(dǎo)致細(xì)胞分裂時(shí)染色體不分裂和細(xì)胞內(nèi)的染色體非整倍性［17］。而活性氧損傷損耗了卵母細(xì)胞內(nèi)的端粒?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸(NAC)能夠保護(hù)卵細(xì)胞內(nèi)的端粒，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量［18］。

5 影響卵巢細(xì)胞端粒長度的可能機(jī)制

端粒長度主要受到端粒酶的調(diào)控。在體外培養(yǎng)的卵巢表皮上皮細(xì)胞(ovarian surface epithelium，OSE)中過度表達(dá)TERT基因能夠維持細(xì)胞內(nèi)的端粒長度，并增加細(xì)胞的分裂潛能。在前竇狀卵泡中，顆粒細(xì)胞端粒酶活性較高，分裂最為旺盛;隨后端粒酶活性逐漸降低，顆粒細(xì)胞分裂逐漸減緩［19］，表明卵泡正常發(fā)育需要維持端粒酶活性。

雌激素參與調(diào)控卵巢內(nèi)端粒酶的活性。雌激素與胞內(nèi)的雌激素受體(estrogen receptor，ESR)形成復(fù)合體，結(jié)合靶基因啟動(dòng)子上的雌激素反應(yīng)元件(estrogen receptor elements，ERE)，調(diào)控靶基因的表達(dá)。雌激素受體包括ESR1(ERα)和ESR2(ERβ)兩類，二者存在于顆粒細(xì)胞中且都參與hTERT基因調(diào)控，以ESR2為主。同時(shí)ESR1在排卵、黃體生成和間質(zhì)腺體發(fā)育中也發(fā)揮著特殊的作用。

雌激素主要通過兩種方式調(diào)控TERT基因表達(dá):1)雌激素受體ESR1直接作用于TERT基因啟動(dòng)子的ERE上，并上調(diào)端粒酶的表達(dá)［20］;2)雌激素刺激轉(zhuǎn)錄因子MYC的表達(dá)［21］，再進(jìn)一步通過Aurora-a激酶、腫瘤抑制因子BACR1、tgf-β、信號(hào)傳導(dǎo)因子SMAD3和促分裂素原活化蛋白激酶MAPK來調(diào)節(jié)TERT基因的表達(dá)。中國POF患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的TGF-β 受體 TGFBR3 錯(cuò)義突變［22］，影響了 TGF-β 通路中的轉(zhuǎn)錄因子Smad家族對(duì)卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞增殖調(diào)控［23］，其中 Smad3能夠通過 MYC作用于hTERT啟動(dòng)子的E-box元件結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的hTERT 表達(dá)［24］。

其次，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)通過MAPK作用于TERT基因啟動(dòng)子，調(diào)控端粒酶的活性。POF患者卵巢內(nèi)的EGF水平顯著低于正常人，說明EGF表達(dá)與POF有關(guān)。EGF能夠激發(fā)豬大小卵泡顆粒細(xì)胞中的端粒酶活性，卻對(duì)上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞沒有作用。據(jù)此，某些未知因素通過EGF調(diào)控POF患者體內(nèi)顆粒細(xì)胞的端粒酶活性，并借此調(diào)節(jié)卵巢的功能。

不僅如此，端粒酶的泛素化降解也參與了這一過程。FMR1突變的小鼠卵泡內(nèi)的包括TERT在內(nèi)的蛋白高水平泛素化降解［25］，限制了相關(guān)細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而引起了卵泡提前耗竭。而在許多POF患者卵巢內(nèi)端粒酶活性和表達(dá)都較同齡人低，提示TERT高度泛素化可能與FMR1突變所致POF患者體內(nèi)卵泡耗竭有關(guān)。

端粒酶活性缺失的卵細(xì)胞出現(xiàn)受精異常和胚胎異常分裂。端粒酶缺陷型小鼠也出現(xiàn)了不育。盡管在胚胎的早期分裂階段，同源重組能夠顯著延長端粒，但不足以彌補(bǔ)細(xì)胞中端粒的損失。

除此之外，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)也能影響端粒長度。端粒中富含鳥嘌呤，其中的氨基和亞氨基易被氧化。藥物增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧基團(tuán)(reactive oxygen spieces，ROS)后，胚胎發(fā)育被擾亂。而NAC能夠清除ROS，保護(hù)端粒，防止細(xì)胞凋亡。

綜上所述，POF病因復(fù)雜，目前還沒能找到POF的致病原因。但因?yàn)槎肆：投肆Ｃ概c卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的分裂成熟密切相關(guān)，根據(jù)卵巢中端粒長度和端粒酶活性隨年齡的老化、卵巢功能下降而逐漸降低以及卵巢早衰功能患者端粒酶活性低等臨床發(fā)現(xiàn)，端粒及端粒酶可能為臨床卵巢功能早衰的診斷和治療提供新的途徑，而端粒及端粒酶的相關(guān)研究也有望為診斷和治療卵巢功能早衰提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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