巨型艾美耳球蟲早熟株免疫劑量研究

趙其平，朱順海，韓紅玉，李 莎，翟 頎，梁思婷.2，楊斯涵.3，黃 兵,4，董 輝

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

巨型艾美耳球蟲早熟株免疫劑量研究

趙其平1，朱順海1，韓紅玉1，李 莎1，翟 頎1，梁思婷1.2，楊斯涵1.3，黃 兵1,4，董 輝1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為了確定巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）早熟株合適的免疫劑量，本文設(shè)立7個早熟株免疫攻蟲組、7個母株免疫攻蟲組、1個不免疫攻蟲組和1個不免疫不攻蟲組，7個早熟株/母株免疫組的免疫劑量為孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000個/羽，經(jīng)嗉囊感染，7日齡首次免疫，14日齡以同等劑量進(jìn)行第二次免疫，21日齡以8×104個/羽的同源母株進(jìn)行攻蟲，28日齡結(jié)束試驗(yàn)，以增重、腸道病變記分和卵囊減少率為試驗(yàn)指標(biāo)。對早熟株中免疫保護(hù)效果較好的2個免疫劑量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，免疫方法、試驗(yàn)周期、試驗(yàn)指標(biāo)和攻蟲劑量同第一批試驗(yàn)。結(jié)果顯示：早熟株和母株200、400、600、800、1000、2000個/羽免疫組攻蟲后的增重與健康對照組差異不顯著（P＞0.05），100個/羽免疫組明顯低于健康對照組（P＜0.05）；各免疫組的卵囊減少率均達(dá)90%以上，腸道病變記分均與不免疫攻蟲組差異不顯著（P＞0.05）。用早熟株200、400個/羽進(jìn)行免疫重復(fù)試驗(yàn)，兩個免疫組攻蟲期間的增重和腸道病變記分均與健康對照組差異不顯著（P＞0.05），而與不免疫攻蟲組差異顯著（P＜0.05），其卵囊減少率均在86%以上。研究結(jié)果表明，該巨型艾美耳球蟲早熟株保持了良好的免疫原性，每只雞免疫200或400個孢子化卵囊均可誘發(fā)雞產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力，可考慮以200個孢子化卵囊作為該早熟株在疫苗制備中的推薦免疫劑量。

球蟲；巨型艾美耳球蟲；早熟株；免疫

雞球蟲病是由艾美耳屬（Eimeria）球蟲引起的一種普遍存在的原蟲病，能引起雞生長發(fā)育停滯，飼料報酬降低，甚至死亡，對全球養(yǎng)雞業(yè)每年造成大約20億英鎊損失[1]。長期以來，抗球蟲藥是預(yù)防和控制球蟲病的主要方法，但藥物無節(jié)制的使用導(dǎo)致球蟲抗藥性的大量產(chǎn)生。另一方面，政府和消費(fèi)者希望藥物添加劑能逐步被淘汰[2]。幸運(yùn)的是，用球蟲活疫苗來代替藥物已經(jīng)被證明是可行的方法，目前歐盟約80%的雞群是通過使用商品化球蟲活疫苗來免疫預(yù)防球蟲病[3,4]。

巨型艾美耳球蟲（E. maxima）對雞致病力中等，主要寄生于雞小腸中段，具有分布較廣，危害大，免疫原性最強(qiáng)等特點(diǎn)[5]。在中國，巨型艾美耳球蟲是肉雞養(yǎng)殖中最常見的3種球蟲之一，也是球蟲活疫苗常包含的蟲種之一[6]。前期研究中，我們已獲得一株巨型艾美耳球蟲早熟株。該早熟株致病力比母株弱，免疫原性與母株相當(dāng)，遺傳穩(wěn)定性好，對7種常見抗球蟲藥物敏感[7,8]，可用于球蟲弱毒活疫苗的研制。本文擬研究該早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，為確定推薦免疫劑量和制備球蟲活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 二黃雞，購自上海市某郊區(qū)孵化場，出殼后立即運(yùn)回本所試驗(yàn)動物房飼料。在無球蟲的環(huán)境下喂養(yǎng)，試驗(yàn)前連續(xù)2 d檢查糞便，確認(rèn)無球蟲感染。

1.1.2 蟲株 巨型艾美耳球蟲（E. maxima）上海株（資源號CAAS 2111301），由黃兵等[9]于1995年用單卵囊分離技術(shù)分離于上海市郊區(qū)某大型雞場，潛在期142 h；巨型艾美耳球蟲早熟株（資源號CAAS 2111314），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所誘導(dǎo)獲得，潛在期107 h[7]。兩個蟲株孢子化卵囊置于2.5%的重鉻酸鉀溶液中4℃保存，試驗(yàn)前經(jīng)雞體傳代獲得新鮮卵囊后備用。

1.2 方法

1.2.1 第一批試驗(yàn) 將480只6日齡雛雞逐只稱重，按每組30只雞隨機(jī)分為16組，調(diào)整各組體重基本相同。7日齡進(jìn)行首免，其中第1組～第7組用早熟株免疫，免疫劑量分別為每只雞100、200、400、600、800、1000及2000個孢子化卵囊；第8組～第14組用母株免疫，免疫劑量與早熟株相同。第15組為陽性對照組（不免疫攻蟲組），第16組為空白對照組（不免疫不攻蟲組）。14日齡進(jìn)行二免，各組免疫劑量與首免相同。二免后d7稱重，除第16組外，各組分別用母株進(jìn)行攻蟲，劑量為每只雞8×104個孢子化卵囊。攻蟲后4～7 d，每天收集糞便稱重，用麥?zhǔn)舷x卵計數(shù)法計每克糞便卵囊數(shù)（OPG），統(tǒng)計各組平均每只雞的卵囊排出總量，計算卵囊減少率。28日齡結(jié)束試驗(yàn)，逐只稱重、處死，取小腸進(jìn)行腸道病變記分，并計算21～28日齡期間（攻蟲期間）的增重。試驗(yàn)期間觀察記錄各組雞的精神、食欲、飲水、發(fā)病、死亡及糞便狀況。

1.2.2 第二批試驗(yàn) 根據(jù)第一批試驗(yàn)結(jié)果，對獲得的兩個免疫效果較好的劑量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。取120只雞稱重，按每組30只雞隨機(jī)分為4組，調(diào)整各組體重基本相同。第1組和第2組選取第一批試驗(yàn)免疫效果較好的兩個劑量，第3組為不免疫攻蟲組，第4組為不免疫不攻蟲組。7日齡首免，14日齡二免，21日齡稱重后，除了第4組外，其余各組每只雞接種母株8×104個孢子化卵囊。攻蟲后處理措施、試驗(yàn)周期等與第一批試驗(yàn)相同。

1.2.3 觀測指標(biāo) 用3項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷：①病變記分，參照J(rèn)ohnson和Reid方法[10]，依據(jù)腸道病變程度分別記為0～4分；②相對增重率，以攻蟲后7d間各組的增重占不免疫不攻蟲組增重的百分率。相對增重率＝（各組平均增重÷不免疫不攻蟲組平均增重）×100%；③卵囊減少率，以各組平均每只雞在攻蟲后4～7 d排出卵囊量計算卵囊減少率。卵囊減少率＝（不免疫攻蟲組排出卵囊總量－免疫攻蟲組排出卵囊總量）÷不免疫攻蟲組排出卵囊總量×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對各組的增重及病變記分進(jìn)行方差分析，其中，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 第一批試驗(yàn)巨型艾美耳球蟲早熟株免疫劑量初步試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表可知，從增重方面看，各免疫組的增重均明顯高于不免疫攻蟲組（P＜0.05）；免疫劑量為200、400、600、800、1000、2000個/羽組增重與健康對照組相當(dāng)（P＞0.05），而劑量為100個/羽組的增重明顯低于健康組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，各免疫組出現(xiàn)輕微病變，均與不免疫攻蟲組差異不顯著（P＞0.05）。在卵囊減少率方面，各免疫組僅有少量卵囊排出，卵囊減少率為95.86%～99.88%。綜合增重、腸道病變記分、卵囊減少率等指標(biāo)分析，擬將200和400個/羽作為巨型艾美耳球蟲早熟株的推薦免疫劑量，進(jìn)行第二批試驗(yàn)。

表1 巨型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table 1 The effectiveness of precocious line of Eimeria maxima with different immune dosages

巨型艾美耳球蟲母株免疫劑量初步試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表可知，從增重方面看，劑量為100個/羽組的增重稍高于不免疫攻蟲組，但差異不顯著（P＞0.05），其余各免疫組的增重均明顯高于不免疫攻蟲組（P＜0.05）；劑量為100個/羽組的增重明顯低于健康對照組（P＜0.05），其余各免疫組的增重均與健康對照組差異不顯著（P＞0.05），其中200和400個/羽組的增重最好。在腸道病變記分方面，各免疫組出現(xiàn)輕微病變，均與不免疫攻蟲組差異不顯著（P＜0.05）。在卵囊減少率方面，各免疫組僅有少量卵囊排出，卵囊減少率為93.46%～98.83%。

2.2 第二批試驗(yàn)巨型艾美耳球蟲早熟株免疫劑量200、400個／羽的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表可知，兩個免疫組的增重與健康對照組差異不顯著（P＞0.05），均明顯高于不免疫攻蟲組（P＜0.05）。在腸道病變記分方面，兩個免疫組出現(xiàn)輕微病變，病變記分與健康對照組的差異不顯著（P＞0.05），均明顯低于感染對照組（P＜0.05）。在卵囊產(chǎn)量方面，免疫組的卵囊減少率為86.49%和87.91%。結(jié)果表明，200、400個/羽巨型艾美耳球蟲早熟株均可獲得較好的免疫保護(hù)力，把200個/羽作為推薦免疫劑量。

表2 巨型艾美耳球蟲母株不同免疫劑量的保護(hù)效力Table 2 The effectiveness of parent strain of Eimeria maxima with different immune dosages

表3 巨型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量重復(fù)試驗(yàn)保護(hù)效力Table 3 The effectiveness of precocious line of Eimeria maxima with different immune dosages(Repeated)

3 討論

球蟲進(jìn)入雞體后，不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)力，也對雞體造成不同程度的損傷。所以，一種良好的球蟲活疫苗，不僅需要疫苗蟲株具有良好的免疫原性，而且疫苗中各種類球蟲卵囊的數(shù)量和比例需要搭配科學(xué)、合理，在免疫原性和致病性之間找到一個平衡，既能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力，又不會出現(xiàn)明顯的致病力，產(chǎn)生嚴(yán)重的疫苗反應(yīng)，影響雞只生長發(fā)育、甚至爆發(fā)球蟲病。但是由于雞球蟲種類繁多、變異蟲株多、生活史復(fù)雜，不同種抗原具有特異性、同種不同株之間抗原存在差異、甚至同株不同發(fā)育階段的蟲體抗原成分也不盡相同，所以，每個蟲株的合適的免疫劑量不盡相同，需要通過試驗(yàn)篩選。

目前，球蟲合適的免疫劑量還沒有統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，不同的研究者采用不同的判定指標(biāo)。華紹桂等[11]以成活率、費(fèi)用、料重比、均重、飼料指數(shù)等5項(xiàng)指標(biāo)，Long等[12]以增重和病變記分等2項(xiàng)指標(biāo)。在前期試驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室選用增重、病變記分和卵囊減少率等3項(xiàng)指標(biāo)作為判定指標(biāo)對柔嫩艾美耳球蟲早熟株[13]和堆型艾美耳球蟲早熟株[14]的免疫劑量進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)以母株作為對照，選用相同的指標(biāo)對巨型艾美耳球蟲早熟株的免疫劑量進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，該早熟株的免疫原性與同等劑量的母株的相當(dāng)，具有良好的免疫原性，這與McDonald等[15]、Shirley等[16]、王江清等[17]、董輝等[7]的結(jié)果一致。在自然感染中，巨型艾美耳球蟲生活史的無性階段，尤其是第2代裂殖生殖階段，是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫最重要的階段，而有性生殖階段幾乎沒有免疫原性[18]。與母株相比，巨型艾美耳球蟲早熟株的生活史中缺失了最后的1或2代裂殖生殖[19]，因而不影響其免疫原性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用巨型艾美耳球蟲早熟株與母株免疫雛雞后都能產(chǎn)生一定的保護(hù)力，攻蟲后二者的指標(biāo)規(guī)律性基本一致。攻蟲后，早熟株和母株免疫組均僅有少量卵囊排出，卵囊減少率都超過90%以上；均出現(xiàn)的輕微腸道病變，但與不免疫攻蟲組差異不顯著（P＞0.05），原因可能是攻蟲劑量偏低，不免疫對照組僅出現(xiàn)輕微的病變記分（+1分）；比較二者增重，發(fā)現(xiàn)200～2000個/羽的增重均與健康對照組相當(dāng)（P＞0.05），而100個/羽組的增重均明顯低于健康對照組（P＜0.05），這可能是100個/羽免疫劑量過小，不能使雞產(chǎn)生足夠的基礎(chǔ)免疫力。在200～2000個/羽免疫組中，2000個/羽免疫組的增重稍低于其他免疫組，原因可能是2000個/羽對免疫雞具有較強(qiáng)的致病作用，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞大量損傷而難以在短時間內(nèi)恢復(fù)，影響飼料的轉(zhuǎn)化率和增重。以上結(jié)果上說明，200～1000個/羽均可獲得良好的免疫保護(hù)力。選擇200和400個/羽進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，綜合增重、病變記分和卵囊減少率三個判定指標(biāo)，結(jié)果顯示，兩個免疫組均可獲得良好的免疫效果。

考慮到一個好的疫苗應(yīng)具有低劑量免疫、保護(hù)效果好、成本低等因素，建議將200個/羽作為巨型艾美耳球蟲早熟株的推薦免疫劑。該劑量也與已有研究基本一致。Rose[20]研究發(fā)現(xiàn)單次接種250個巨型艾美耳球蟲卵囊就能獲得較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。樊生超等[21]分別選用巨型艾美耳球蟲早熟株（P12株）200、500、800、1000個卵囊/羽一次性免疫雞，發(fā)現(xiàn)200個卵囊/羽為其最小有效免疫劑量。陶建平等[22]選用11株巨型艾美耳球蟲，每個蟲株免疫劑量為100個/羽，一次性灌服免疫雞，同源攻蟲試驗(yàn)中均獲得較強(qiáng)的臨床免疫力。國外商品化球蟲弱毒疫苗Paracox?含兩株巨型艾美耳球蟲早熟株，每頭份疫苗中含200個巨型艾美耳球蟲CP株和100個巨型艾美耳球蟲MFP株。

本文考察了實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的巨型艾美耳球蟲早熟株不同免疫劑量的保護(hù)效果，初步擬定了制作疫苗的推薦免疫劑量，為研制球蟲疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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STUDY ON THE IMMUNIZING DOSAGES OF A PRECOCIOUS LINE OF EIMERIA MAXIMA

ZHAO Qi-ping1, ZHU Shun-hai1, HAN Hong-yu1, LI Sha1, ZHAI Qi1, LIANG Si-ting1,2, YANG Si-han1,3,HUANG Bing1,4, DONG Hui1
(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. College of Animal Science and Technology, Yunan Agricultural University, Kunming 650201, China; 4. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to determine optimal immunization dose of a precocious line ofEimeria maxima,the first trial was conducted including 7 groups immunized with a precocious line, 7 groups immunized with its parent strain, 1 unimmunized-challenged group and 1 unimmunized-unchallenged group. Dosages of 100, 200, 400, 600, 800, 1000 and 2000 sporulated oocysts of the precocious line or its parent strain were administered orally to 7-day-old chickens for twice at a 7-day interval. Seven days later, all chickens in the challenged grorps were challenged with 8×104sporulated oocysts of the parent strain. Weight gains, intestinal lesion scores and reduction of oocystratios were used to evaluate the efficacy. Weight gains of immunization groups with 200-2000 sporulated oocysts of the precocious line and parent strain had no significant difference from those of unimmunized-unchallenged group (P＞0.05) while weigh gains of immunization groups with 100 sporulated oocysts were signif cantly lower than those of unimmunized-unchallenged group (P ＜ 0.05). Oocyst production were reduced over 90% in all immunization groups. Intestinal lesion scores of all immunization groups were similar to those of unimmunized-challenged group (P ＞ 0.05). The effectiveness of doses of 200 and 400 sporulated oocysts of precocious line were repeated. Both weight gains and intestinal lesion scores of these two immunization groups were similar to those of unimmunizedunchallenged group (P ＞ 0.05), but signif cantly different from those of unimmunized-challenged group (P ＜ 0.05). Reduction of oocysts ratios was over 86%. Results from both trials demonstrated that the precocious line of E. maxima maintains good immunogenicity and could induce suff cient immunological protection at 200/400 immunizing dosage. Therefore, 200 sporulated oocysts were determined to be optimal immunization dose.

Coccidia;Eimeria maxima;precocious line; immunization

S852.723

A

1674-6422（2014）06-0032-06

2014-06-13

上海市科委重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（12391902200）

趙其平，男，獸醫(yī)師，主要從事球蟲保種技術(shù)與球蟲病防治研究

董輝，E-mail：donghui@shvri.ac.cn