一株寬宿主譜裂解性大腸桿菌噬菌體的進(jìn)化分析

周 艷，包紅朵，張 輝，張莉莉，王 冉

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所 江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 21004）

一株寬宿主譜裂解性大腸桿菌噬菌體的進(jìn)化分析

周 艷，包紅朵，張 輝，張莉莉，王 冉

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所 江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 21004）

裂解性噬菌體能夠特異性裂解細(xì)菌，本研究分析了一株從自然界中分離的寬宿主譜裂解性大腸桿菌噬菌體的種屬和進(jìn)化關(guān)系。前期用Adams雙層平板瓊脂法從豬場(chǎng)污水中分離純化出一株裂解性噬菌體vB_EcoM_JS09，裂解譜分析能夠裂解禽致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。擴(kuò)增分析gene18、gene 23序列，并根據(jù)gp18和gp23氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析JS09的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明噬菌體vB_EcoM_JS09基因組為dsDNA，屬于有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、T4-like噬菌體、T-evens亞群。其gp18氨基酸序列與大腸桿菌噬菌體RB69同源性最高，為100%；gp23氨基酸序列與大腸桿菌T4噬菌體同源性最高為96%。該結(jié)果為禽致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的防控提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

禽致病性大腸桿菌；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；寬宿主譜裂解性大腸桿菌噬菌體；T4-like噬菌體；進(jìn)化分析

噬菌體（bacteriophage）廣泛存在于自然界，是數(shù)量和種類最多的生物體[1-5]。噬菌體能夠特異性的裂解并殺死細(xì)菌，分離并研發(fā)其作為新型抗菌生物制劑已成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)之一[4-8]。研究較多較詳細(xì)，并成為模式噬菌體的是T偶數(shù)噬菌體，如T2、T4和T6噬菌體[3,9,10]。近年來(lái)人們逐漸分離并研究了很多T4-like噬菌體。T4-like噬菌體代表為T4噬菌體，基因組為dsDNA，屬于有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科?；诨蛐蛄斜葘?duì)，可把T4-like分為四個(gè)亞群：T-evens亞群、pseudo T-even亞群、schizo T-even亞群和exo T-even亞群[3]。T-even亞群中的噬菌體分離自腸道菌，其DNA序列與T4噬菌體相似性較高。然而有研究發(fā)現(xiàn)T4-like噬菌體的種類較多，超出了這幾個(gè)亞群分類[11]。T4-like噬菌體具有一個(gè)較長(zhǎng)多面體頭部，長(zhǎng)且可收縮的尾部，形態(tài)以及基因組大小接近于T4噬菌體[3,9]。盡管T4-like噬菌體之間有差異，它們?cè)谶z傳進(jìn)化上具有親緣關(guān)系，如衣殼蛋白、尾蛋白和DNA復(fù)制酶基因中仍保留了的保守同源區(qū)域，其中g(shù)ene 18和gene 23與T4噬菌體存在同源性較高序列[3]。因此，在本研究中將這兩個(gè)基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行序列比對(duì)和噬菌體的進(jìn)化分析。

禽致病性大腸桿菌（Avain pathogenicE.coli，APEC）是一類致禽類急性的、全身性疾病的腸道外的病原性大腸桿菌，禽類感染后主要表現(xiàn)為氣囊炎、肺炎、心包炎、肝周炎、腹膜炎、輸卵管炎等，或表現(xiàn)為急性敗血癥、腫頭綜合癥或雛雞臍炎，給世界范圍內(nèi)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失，禽致病性大腸桿菌也是重要的人畜共患病原菌[12]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）是一類能夠?qū)е氯撕陀仔笕绯跎胸i等腹瀉最常見(jiàn)的病原性大腸桿菌[13]。寬宿主譜大腸桿菌裂解性噬菌體vB_EcoM_JS09（簡(jiǎn)稱JS09），用Adams雙層平板瓊脂法[14]分離自江蘇省射陽(yáng)市某豬場(chǎng)污水中，經(jīng)鑒定能夠裂解禽致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。對(duì)其gp18和gp23氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，鑒定JS09為一株T4-like噬菌體。本研究對(duì)這一株新分離的寬宿主譜大腸桿菌噬菌體的種屬和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，為禽致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的防控提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種和噬菌體樣品來(lái)源禽致病性大腸桿菌菌株和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌均分離自病雞肝臟；寬宿主譜裂解性大腸桿菌噬菌體JS09分離自豬場(chǎng)污水（GenBank登錄號(hào)：KF582788），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物和主要試劑DNaseI、RNaseA和MungBeanNuclease購(gòu)自Sigma生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；蛋白酶K購(gòu)自Amresco公司；引物由上海生工公司合成；EcoRI、HindIII、DNAMarker、LATaq酶和PCR所用試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；T4連接酶購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、PEG8000、瓊脂糖、氨芐青霉素等化學(xué)試劑為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 噬菌體的純化和基因組的提取擴(kuò)增培養(yǎng)JS09噬菌體至104pfu/mL，APEC菌株濃度至109cfu/mL。按照1:10比例接種噬菌體和菌株，混合至錐形瓶，室溫靜置吸附15min，加入40mLLB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。將含有噬菌體JS09的裂解培養(yǎng)物冷卻至室溫，PEG8000沉淀法純化培養(yǎng)物中的噬菌體顆粒，保存于SM緩沖液（NaCl5.8g、MgSO4·7H2O2g、pH7.5、Tris·Cl1mol/L、2%gelatin5mL，ddH2O補(bǔ)足至1L）中[15-17]。苯酚/氯仿/異丙醇法提取SM中噬菌體的基因組，單酶切鑒定噬菌體基因組，10μL酶切體系為EcoRI/HindIII1μL、10×bufferH1μL、基因組模板（10倍稀釋）5μL，補(bǔ)足ddH2O至10μL，渦旋混勻后37℃酶切3h。用DNaseI、RNaseA和MungBeanNuclease酶切處理鑒定基因組類型[15-17]。

1.4 噬菌體gene18與gene23的擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[4]引物，分別擴(kuò)增噬菌體gene18與gene23序列（表1）。以噬菌體JS09基因組DNA為模板。PCR反應(yīng)體系：10×PCRbuffer5μL，dNTPmix（2.5mM）4μL，MgCl25μL，上下游引物各1μL，基因組模板（10倍稀釋）2μL，補(bǔ)足滅菌ddH2O50μL。PCR程序：94℃預(yù)熱4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用膠回收試劑盒純化回收目的片段，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 gene 18和gene 23擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in PCR of gene 18 and gene 23

1.5 噬菌體遺傳進(jìn)化分析在NCBI分別獲取11株噬菌體RB32、RB69、T4、RB49、RB42，RB16、RB43、KVP40、Aeh1、nt-1、vB_EcoM_CBA120的gp18氨基酸序列，用DNAStar將測(cè)得的JS09的gene18核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。將這11株序列與測(cè)得的JS09的gp18氨基酸序列用DNAStar中的MegAlign軟件進(jìn)行g(shù)p18氨基酸序列比對(duì)，TreeView1.6 .6軟件構(gòu)建噬菌體系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體JS09的分離和其基因組的特點(diǎn)EcoR I和Hind III分別單酶切純化的噬菌體JS09基因組，1%瓊脂糖凝膠電泳表明提取出了JS09基因組（圖1）。經(jīng)DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease酶切處理后，電泳結(jié)束表明基因組為雙鏈DNA。除大腸桿菌T4噬菌體之外，近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)了很多T4-like噬菌體。據(jù)報(bào)道在電鏡觀察下，已分離到了5500株噬菌體，但僅獲得了555株噬菌體的基因組全序列，其中腸桿菌噬菌體僅約為70株[1]。隨著從自然界分離的噬菌體種類的增多，對(duì)噬菌體的形態(tài)、生物學(xué)特性和基因的了解已不再局限于幾種模式噬菌體[18]?？股氐臑E用產(chǎn)生了許多危害，抗藥性細(xì)菌給人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了危害以及巨大的經(jīng)濟(jì)損失，分離鑒定能夠裂解病原菌的噬菌體成為首要解決的問(wèn)題。因此分離新的噬菌體，建立不同噬菌體之間的進(jìn)化關(guān)系，有助于鑒定一株新分離的噬菌體，也為進(jìn)一步研究噬菌體的生物多樣性和進(jìn)化變異提供了途徑[18-20]。

圖1 JS09基因組單酶切鑒定Fig.1 Identif cation of JS09 genome digested by resitriction endonucleases enzyme

2.2 gene 18與gene 23的擴(kuò)增和序列比對(duì)結(jié)果以純化的噬菌體JS09基因組為模板，兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出目的片段gene 18和gene 23，與預(yù)期片段大小一致，分別約為1330 bp和850 bp（圖2）。在本研究中，基于gene 18和gene 23保守序列擴(kuò)增，將所測(cè)的序列結(jié)果，通過(guò)NCBI Blast搜索同源性較高的序列，共有9株噬菌體的gene 18核苷酸序列與JS09同源性較高，為76%～98%，其中與大腸桿菌噬菌體HX01核苷酸同源性最高，為98%。將獲得的部分gene 18核苷酸序列轉(zhuǎn)換為333個(gè)氨基酸序列后，與大腸桿菌噬菌體RB69同源性最高，為100%；而S09 gene 23核苷酸序列與大腸桿菌噬菌體HX01核苷酸同源性最高，為99%，將獲得的部分gene 23核苷酸序列轉(zhuǎn)換為264個(gè)氨基酸序列后，與大腸桿菌噬菌體T4同源性最高，為96%。參考GenBank上已公布的噬菌體基因組序列和文獻(xiàn)中的噬菌體形態(tài)，噬菌體JS09的gene 18和gene 23核苷酸序列與大腸桿菌噬菌體HX01同源性最高，HX01屬于有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、T4-like噬菌體。HX01的宿主菌也為禽致病性大腸桿菌，該噬菌體分離自鴨場(chǎng)[21]，而本研究中JS09分離自豬場(chǎng)污水。根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)，噬菌體RB69、T4與vB_EcoM_JS09宿主譜不同，RB69的宿主為E.coliB/5[10]，T4的宿主為E.coliK-12株系[23]。然而尚未有報(bào)道表明RB69和T4噬菌體能夠裂解禽致病性大腸桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。

在隨后的全基因組測(cè)序研究中，JS09的gp18蛋白即gp18 tail sheath protein 含有660個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與大腸桿菌RB69同源性為100%，屬于蛋白家族18 superfamily。JS09的gp23蛋白即major capsid protein含有155個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與大腸桿菌RB69同源性為100%，屬于蛋白家族gp23。在T4-like噬菌體中，18 superfamily 和gp23均為保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于T4-like噬菌體。這表明JS09的gene 18和gene 23在遺傳進(jìn)化上很保守。而在分類上噬菌體HX01、T4噬菌體和噬菌體RB69都屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科、T4-like噬菌體、T-evens亞群，基因組均為雙鏈DNA。

圖2 gene 18和gene 23的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplif cation results of gene 18 and gene 23

2.3 JS09遺傳進(jìn)化分析基于gp18氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），JS09與T4噬菌體、RB69關(guān)系較近；而基于gp23氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與之基于gp18構(gòu)建的（圖省略）。本研究中新分離的JS09屬于有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、T4-like噬菌體、T-even亞群。T-even亞群與T4噬菌體在基因組序列上具有較高相似性，而pseudo T-even亞群、schizo T-even亞群和exo T-even亞群與T4噬菌體在序列相似性上較低。與T4噬菌體比對(duì)，T-even亞群、pseudo T-even亞群、schizo T-even亞群和exo T-even亞群gp23氨基酸序列相似性分別為90%、60%、50%和30%。研究表明RB69與T4噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)圖譜大部分相對(duì)應(yīng)，且大多數(shù)基因接近[11]。因此對(duì)于RB69以及T4噬菌體的研究有助于改造或克隆JS09相關(guān)基因，從而將JS09應(yīng)用于致病性大腸桿菌病的防治上。

結(jié)合我們對(duì)JS09的電鏡形態(tài)觀察，以及對(duì)其高通量測(cè)序獲得的全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：KF582788）比對(duì)分析表明，基于gene 18和gene 23序列對(duì)JS09的分類是可靠的。雖然在自然界的進(jìn)化變異中，噬菌體形態(tài)、宿主特異性和基因組也在發(fā)生演變[22]。但在這些T4-like噬菌體中，仍保留著高度保守的基因序列。因此在噬菌體電鏡形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，基于保守的gene 18和gene 23序列，可以初步鑒定一株T4-like噬菌體。在第九次國(guó)際病毒分類委員會(huì)上，將RB69歸為未界定的T4-like噬菌體，但在國(guó)外報(bào)道的文獻(xiàn)中將RB69作為T4-like噬菌體來(lái)研究，因此JS09至少是與噬菌體T4相關(guān)的噬菌體。

目前已知的大部分T4-like噬菌體分離自腸道菌，這些噬菌體主要屬于T-evens亞群。在T4-like噬菌體中，T4噬菌體作為模式噬菌體，研究最為詳細(xì)。在自然界分離的一些噬菌體，由于在形態(tài)和基因組序列上與T4噬菌體相似，故稱為T4-like噬菌體[9]。目前僅得到了約40株T4-like噬菌體的基因組序列[9]。研究認(rèn)為，T4-like噬菌體來(lái)源于T4噬菌體。而本研究中，JS09株形態(tài)和基因組大小類似于T4噬菌體，因此參照已有的模式噬菌體，有助于研究JS09噬菌體與宿主之間的相互作用、抗性機(jī)制以及進(jìn)化關(guān)系等。

圖3 基于gp18氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by the TreeView1.6.6 program using the amino sequence of gp18 from 12 T4-like phages

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PHYLOGENETIC ANALYSIS OF A BROAD-HOST-RANGE LYTIC COLIPHAGE

ZHOU Yan, BAO Hong-duo, ZHANG Hui, ZHANG Li-li, WANG Ran
(Key Lab of Animal-derived Food Safety of Jiangsu Province, Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Institute of Food Safety and Quality, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Lytic bacteriophage (phage) can kill bacteria. This study analyzed the classification and phylogeny of a broad-host-range lytic coliphage isolated from the nature. In a previous study, a strain of phage vB_EcoM_JS09 was isolated by using Adams doublelayer agar plate method and purif ed from the sewage of a swine farm. The genome was extracted through phenol chloroform isopropanol method, then treated with DNase I, RNase A and Mung Bean Nuclease. The conserved tail sheath gene 18 and major capsid protein gene 23 of T4-like phages were amplif ed using the reported primers and JS09 as a template and their deduced amino acid sequences were used for phylogenetic tree analysis. Results showed that lytic coliphage JS09 had the genome of double stranded DNA, belonging to the Caudovirales, Myoviridae, T4-like phage, T-even subgroups. The homology of amino acid sequence of gp18 was 100% with E. coli phage RB69 while that of gp23 shared 96% identity to E. coli T4 phage. The results provide a good foundation for the biology of Avian pathogenicEscherichia coliand enterotoxigenicEscherichia coliprevertion Cuel control.

Avain pathogenicE.coli;enterotoxigenicE.coli;broad-host range lytic coliphage; T4-like phage; phylogenetic analysis

S852.612

B

1674-6422（2014）06-0071-06

2014-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31402234）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012788）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金（CX(13)3086）

周艷，女，助理研究員，主要從事噬菌體防控致病菌研究

王冉，E-mail：wangran2001@126.com