蛋鴨坦布蘇病毒與金黃色葡萄球菌混合感染的診治

李志杰，提金鳳,2，李 舫，楊明彩

（1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，濰坊 261061；2. 山東農業(yè)大學，泰安 261000）

蛋鴨坦布蘇病毒與金黃色葡萄球菌混合感染的診治

李志杰1，提金鳳1,2，李 舫1，楊明彩1

（1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，濰坊 261061；2. 山東農業(yè)大學，泰安 261000）

山東省某養(yǎng)鴨場蛋鴨發(fā)病，通過臨床診斷及實驗室檢測最終確診為坦布蘇病毒與金黃色葡萄球菌混合感染。通過對感染鴨群進行對癥治療和抗生素治療，控制住了病情，減少了經濟損失。

坦布蘇病毒；金黃色葡萄球菌；蛋鴨；診治

2010年4月以來，我國福建省、浙江省、江蘇省、廣西壯族自治區(qū)、山東省、安徽省、河北省、河南省等地相繼出現蛋鴨產蛋率下降的病例，與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染后的臨床特點非常相似，但采用針對這兩種病毒的控制方法來控制疫情均無效，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失。通過各高校院所的禽病專家學者的一致努力，最終確定了該病的病原是一種黃病毒，即坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，TMUV），2011年中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統(tǒng)一定為“鴨坦布蘇病毒病”[1-3]。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群。該病毒是20世紀 70 年代在馬來西亞首次從庫蚊體內分離到并命名，但有關病毒的致病性及所感染宿主的范圍尚未確定。2000年前后，在對馬來西亞實兆遠地區(qū)某肉雞養(yǎng)殖場中爆發(fā)的肉雞癱瘓的病例調查過程中，分離到了一株TMUV分離株并將其命名為實兆遠病毒（Sitiawan virus，SV），這是首次確定TMUV對禽類有致病性[4]。到目前為止，已經確定鴨坦布蘇病毒能感染蛋鴨、種鴨、雛鴨、雞、鵝、鴿子、麻雀等禽類[5,6]。

本研究通過對山東省聊城市某養(yǎng)鴨場的發(fā)病蛋鴨進行臨床診斷與實驗室檢測，最終確定了鴨群不僅感染了鴨坦布蘇病毒，還混合感染了金黃色葡萄球菌，并根據診斷結果對鴨群進行了治療，治療效果良好，為鴨場降低了經濟損失。

1 材料與方法

1.1 病例山東省聊城市某養(yǎng)鴨場共養(yǎng)殖8000只蛋鴨，26周齡前后開始出現產蛋率驟降的情況。

1.2 主要試劑Trizol購自北京全仕金公司；dNTP反轉錄、TaqDNA聚合、DNAMarker（DL2000）購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 主要試驗材料9～11日齡鴨胚、勻漿器、注射器、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基。

1.4 臨床診斷觀察發(fā)病鴨群臨床癥狀，同時進行剖檢。

1.5 病毒的分離鑒定取病死鴨的病變卵泡膜，經常規(guī)處理后，尿囊腔接種9～11日齡的SPF雞胚，0.2mL/只，接種后的雞胚放在37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。棄掉24h以內死亡的雞胚，保留24h后死亡的雞胚，同時收集死亡雞胚的尿囊液。觀察死亡雞胚的病變特點。對收集的尿囊液分別進行鴨坦布蘇病毒、新城疫病毒和低致病性禽流感病毒常規(guī)RT-PCR檢測。根據GenBank發(fā)布的鴨坦布蘇病毒的基因序列，通過比對后依據NS1的保守基因序列設計引物：P1：5′-CTTTGGGTTTGGAGTGTTG-3′，P2：5′-CTTGTATCCTGTCCTCGTGTT-3′。將擴增的片段與pMD18-T載體連接后克隆至DH5α，送上海英濰捷基生物有限公司進行測序。

新城疫病毒和低致病性禽流感病毒的檢測引物均依據國標進行設計，由上海英濰捷基生物有限公司合成。

1.6 細菌涂片鏡檢無菌取病死鴨的關節(jié)液以及腫大的肝臟、脾臟分別進行涂片，革蘭氏染色后進行鏡檢。

1.7 細菌分離鑒定無菌取病死鴨的關節(jié)液及腫大的肝臟、脾臟，分別在普通培養(yǎng)基、鮮血瓊脂上進行分區(qū)劃線，37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h，觀察菌落的形態(tài)。將長出的單個菌落進行涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡鏡檢。

1.8 細菌生化試驗及RT-PCR鑒定將獲得的單個細菌菌落用肉湯培養(yǎng)基37℃進行增菌培養(yǎng)，取0.3mL肉湯培養(yǎng)物與0.5mL凝固酶試驗兔血漿于試管內充分混合，置37℃溫箱中培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h，以內容物完全凝固、試管倒置或傾斜時不流動者為陽性。

參照文獻中已經發(fā)表的金黃色葡萄球菌16s rRNA基因的保守序列設計引物，以培養(yǎng)的菌株的基因組作為模板進行RT-PCR[7,8]。將擴增的片段與pMD18-T載體連接后克隆至DH5α，送上海英濰捷基生物有限公司進行測序。

2 結果與討論

2.1 臨床診斷結果通過觀察，病鴨特征性癥狀主要表現為：精神沉郁、食欲下降，產蛋率在5 d內從80%逐漸下降至30%左右；有的病鴨在發(fā)病后期出現站立不穩(wěn)、倒地震顫、歪脖、癱瘓、轉圈等神經癥狀，有的病鴨跗跖關節(jié)高度腫脹，腫脹部位呈現淡紫色（圖1）；個別病鴨最終出現衰竭死亡。

病死鴨的剖檢病變主要表現為：卵泡充血、出血、萎縮，甚至破裂，形成卵黃性腹膜炎（圖2）；有的病死鴨腦膜水腫、充血、出血等，有的病死鴨肝臟、脾臟極度腫大、色淡；對于病死鴨的腫脹關節(jié)進行剖檢發(fā)現，關節(jié)腔中的關節(jié)液增多、粘稠，有的關節(jié)液呈現淡紫紅色。

圖2 病死鴨卵泡充血、出血、萎縮Fig.2 Follicular hyperemia, hemorrhage, atrophy in diseased ducks

根據蛋鴨的發(fā)病情況、臨床癥狀及剖檢病變進行初步診斷，該鴨群疑似混合感染了坦布蘇病毒和金黃色葡萄球菌。

2.2 病毒的分離鑒定將常規(guī)處理后的病變卵泡膜接種雞胚后，雞胚在3～5 d內死亡，死亡雞胚的尿囊膜增厚，胚體頭部、頸部出血，肝臟出血、有白色壞死點。

利用設計的鴨TMUV引物，對收集的死亡雞胚的尿囊液通過常規(guī)RT-PCR方法進行檢測，擴增出大小為312 bp的目的片段（圖3）。將獲得的片段送至上海英濰捷基生物有限公司進行測序，測序結果進行Blast，與鴨TMUV NS1基因序列完全相符。用NDV和AIV的特異性引物進行檢測，均沒有擴增出目的片段（結果未顯示）。

圖3 雞胚尿囊液TMUV NS1片段擴增結果Fig.3 Amplif cation of TMUV NS1 gene in allantoic f uid

2.3 細菌涂片鏡檢及分離鑒定無菌取病死鴨的關節(jié)液及腫大的肝臟、脾臟分別進行涂片，革蘭氏染色，然后進行鏡檢。顯微鏡下均能觀察到藍紫色、圓形的小球菌，無其他形態(tài)的細菌出現。

無菌取病死鴨的關節(jié)液及腫大的肝臟、脾臟，利用普通培養(yǎng)基和鮮血瓊脂進行細菌的分離培養(yǎng)。結果顯示，普通培養(yǎng)基和鮮血瓊脂上均長出了灰白色、圓形、光滑濕潤的大菌落，普通培養(yǎng)基的菌落在室溫下作用一定時間后顏色變成金黃色，鮮血瓊脂上的菌落周圍有溶血環(huán)。

將長出的單個菌落進行涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡鏡檢，能觀察到成串的藍紫色、圓形小球菌（圖4），根據以上結果初步鑒定為金黃色葡萄球菌感染。

圖4 病鴨體內金黃色葡萄球菌的分離與鑒定Fig.4 Isolation and identif cation of Staphylococcus in diseased ducks

2.4 細菌生化試驗及RT-PCR鑒定利用獲得的細菌的肉湯培養(yǎng)物進行血漿凝固酶試驗，反應6 h后內容物完全凝固，進一步證實為金黃色葡萄球菌感染。

采用金黃色葡萄球菌16s rRNA特異性引物進行PCR擴增，在450 bp左右處擴增出了目的片段（圖5）。

圖5 細菌16s rRNA 擴增片段Fig.5 Amplif cation of Staphylococcus 16s rRNA

將擴增得到的片段送至上海英濰捷基生物有限公司進行測序，測序結果進行Blast，與金黃色葡萄球菌16s rRNA基因序列完全相符。

2.5 治療措施對于鴨群感染坦布蘇病毒，目前沒有特異的治療方法，只能采用對癥治療。首先將發(fā)病鴨隔離飼養(yǎng)，清潔鴨舍及周圍的運動場，保持鴨舍的干燥通風。每天早晚用百毒殺、過氧乙酸或新吉爾滅等對鴨舍、料槽、水槽、運動場及周圍環(huán)境等進行消毒，至少保持1周。其次，建議發(fā)病鴨群飲用黃芪多糖、雙黃連等抗病毒中藥。通過藥敏試驗選擇對金黃色葡萄球菌敏感的藥物，如環(huán)丙沙星、氨芐青霉素等。同時給鴨群補充電解多維、Vc等，提高機體的抵抗力。對于尚未發(fā)病的鴨群可以采用預防劑量的抗病毒中藥及復合抗生素飲水，同時在飲水中添加電解多維等，防止發(fā)病。

采取以上措施后，病鴨的食欲、飲水、精神等明顯好轉，產蛋率也逐漸恢復，沒有再出現新發(fā)病例。

2.6 鴨坦布蘇病毒病是近幾年出現的新病，自從2010年在我國首次爆發(fā)以來，迅速席卷了我國絕大多數養(yǎng)鴨地區(qū)，幾乎所有蛋種鴨場都未能幸免，部分地區(qū)的商品鴨發(fā)病也很嚴重。該病主要造成產蛋種鴨產蛋率嚴重下降，且恢復緩慢，一般需要1～2個月，后期死淘率上升；商品鴨發(fā)病后主要表現為顫栗、歪頸、癱瘓等神經癥狀，死亡率升高，一般在10%～30%左右，嚴重的甚至高達80%，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失[9,10]。對于該病的傳染源、傳播途徑或感染方式以及公共衛(wèi)生學等方面尚未有定論，目前關于該病的很多研究還在進行中。

由于鴨坦布蘇病毒病與新城疫、禽流感的臨床癥狀及病變非常相似，因此該病最早在鴨群中出現時被誤診為禽流感、新城疫，由于防治措施不對癥，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失。該病最早是通過實驗室檢測確診?，F在關于坦布蘇病毒感染的實驗室檢測方法也陸續(xù)建立起來了，如LAMP法、ELISA法、巢式PCR法等。本研究通過PCR等實驗室檢測方法有效鑒定了疫情，并給與了及時治療，有效控制了疫情，避免了巨大經濟損失。

[1] Cao Z , Zhang C, Liu Y,et al.Tembusu virus in ducks, China[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(10): 1873-1875.

[2] Su J, Li S, Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related flavivirus[J]. PloS one, 2011, 6(3): e18106.

[3] Yan P, Zhao Y, Zhang X,et al.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology, 2011, 417(1): 1-8.

[4] Kono Y, Tsukamoto K, Abd Hamid M,et al.Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus, a new isolate belonging to the genus Flavivirus[J]. Am J Trop Med Hyg, 2000, 63(1-2): 94-101.

[5] Tang Y, Diao Y, Yu C,et al.Characterization of a Tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows (Passer domesticus) in Northern China [J]. Transbound Emerg Dis, 2013, 60(2), 152-158.

[6] Tang Y, Diao Y, Gao X,et al.Analysis of the complete genome of Tembusu virus, a flavivirus isolated from ducks in China[J]. Transbound Emerg Dis, 2012, 59(4), 336-343..

[7] 鄧海平, 蒲萬霞, 梁劍平, 等. 牛源金黃色葡萄球菌16s rRNA分子鑒定與隨機多態(tài)性擴增分型[J].中國獸醫(yī)雜志, 2011, 47(4): 9-12.

[8] 鄧海平, 蒲萬霞, 梁劍平 ,等. 貴州地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌分離株16s rRNA分子鑒定與RAPD分型研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(1): 112-115.

[9] Yu K, Sheng Z Z, Huang B,et al.Structural, antigenic, and evolutionary characterizations of the envelope protein of newly emerging Duck Tembusu Virus[J]. PloS one, 2013, 8(8): e71319.

[10] Yun T, Zhang D, Ma X ,et al.Complete genome sequence of a novel flavivirus, duck tembusu virus, isolated from ducks and geese in China[J]. J Virol, 2012, 86(6), 3406-3407.

DIAGNOSIS AND TREATMENT OF MIXED INFECTION OF TEMBUSU VIRUS AND STAPHYLOCOCCUS IN LAYER DUCKS

LI Zhi-jie1, TI Jin-feng1,2, LI Fang1, YANG Ming-cai1
(1. Shandong Animal Science and Veterinary Vocational College, Weifang 261061, China; 2. Shandong Agricultural University, Taiˊan 261000, China)

A disease broke out in layer ducks on a farm in Shandong province, which was later diagnosed as a mixed infection of Tembusu virus and staphylococcus according to clinical signs and laboratory testing. The diseased ducks received symptomatic treatment and antibiotic therapy and gradually got back to health. The economic losses of affected duck farms were reduced due to prompt diagnosis and treatment.

Tembusu virus;Staphylococcus; layer ducks; infection

S852.659.6

B

1674-6422（2014）06-0077-04

2014-08-11

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系家禽創(chuàng)新團隊建設項目（家禽疫病防控崗位SDAIT-13-011-05）；國家級星火計劃項目（2011GA740033）；濰坊市科學技術發(fā)展計劃（2013YD139）

李志杰，男，講師，主要從事家禽疾病防治及研發(fā)工作

李舫，女，E-mail：sdmylifang@163.com