上海市三株H9N2鴨禽流感病毒全基因遺傳進化分析

葛菲菲，劉 健，楊德全，鞠厚斌，葛 杰，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

上海市三株H9N2鴨禽流感病毒全基因遺傳進化分析

葛菲菲，劉 健，楊德全，鞠厚斌，葛 杰，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

為了解上海市鴨群中H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的遺傳變異特征，以及與疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之間的遺傳距離，對2007年和2009年分離自上海市鴨氣管和泄殖腔樣品采用熒光RT-PCR檢測，將H9亞型禽流感病毒核酸陽性樣品處理后，經(jīng)雞胚尿囊腔接種分離病毒，HI進一步確定血凝素( haemagglutin,HA）亞型，隨后進行了全基因測序，并結(jié)合GenBank中的相關(guān)序列進行遺傳進化分析。結(jié)果表明：3株分離毒株為H9N2亞型鴨禽流感病毒，HA蛋白裂解位點的氨基酸組成為PARSSRGLF，符合低致病性禽流感病毒特征，均屬于經(jīng)典的H9N2 Ck/Bei群系；NA基因均屬于Y280系；NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亞型）歸為一群；PB2和M基因?qū)儆赒a/HK/G1/97系；NS基因仍為Ck/Bei系；2007年的分離株和2009年的分離株在PB1基因上分屬不同亞群。3株病毒的HA1基因與疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998 之間的遺傳距離均大于7%。由此可見，3株鴨H9N2亞型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亞群間發(fā)生自然重排的產(chǎn)物，現(xiàn)有疫苗對分離株的保護性需要進一步評估。

H9N2亞型禽流感病毒；遺傳進化分析；遺傳距離

禽流感（avian influenza，AI）是一種由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類烈性傳染病，其病原屬于正黏病毒科、流感病毒屬。H9N2亞型AIV為低致病性禽流感病毒，不僅在全世界范圍的禽類中廣泛流行，而且可以感染人。在鴨群中H9亞型AIV很少引起發(fā)病，但水禽尤其鴨是流感病毒的貯存庫，對AIV的發(fā)生及傳播起到了非常重要的作用。H9N2亞型AIV可經(jīng)污染的飛沫、塵埃、飼料等傳播，傳播速度快、范圍廣。各種日齡混養(yǎng)的禽場一旦受污染，不容易將其根除，疫情隱患長期存在。各品種鴨及鵝均可感染H9N2亞型AIV，但在鴨中以雛番鴨發(fā)病率、病死率最高[1]。各種日齡水禽均可感染發(fā)病，但臨床上以10～15日齡多發(fā)，其呼吸道癥狀較重，使用一般慢性呼吸道病的藥物治療對呼吸道癥狀無效。病程長為14～30 d，無死亡高峰期，多呈平緩性死亡，死亡率為2%～20%。在以鴨為主的水禽或野禽發(fā)生H9N2亞型禽流感后，多數(shù)不出現(xiàn)臨床癥狀，成為帶毒宿主，長期帶毒和排毒，在H9N2亞型AIV傳播中起到很重要的作用[2]。最新研究證明，H9N2亞型AIV在家禽中短期傳播后，可突變成致病性高的病毒。發(fā)生H9N2亞型禽流感疫情的種（蛋）鴨、種鵝主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋異常，極易繼發(fā)或并發(fā)感染細菌性疾病、寄生蟲病或其他病毒性疾病等，并且致使這些疫病病死率明顯升高。無論圈養(yǎng)還是散養(yǎng)，單一飼養(yǎng)還是混養(yǎng)，肉鴨（鵝）、蛋鴨、種鴨（鵝）幾乎均有發(fā)病、死亡情況，只是發(fā)病率、病死率高低不同而已。因此，對分離自鴨的H9N2亞型AIV進行基因進化分析，評估目前使用的H9N2禽流感疫苗株對其保護效率，不僅在病毒學、獸醫(yī)學上有重要的學術(shù)意義，同時也具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚A/Duck/Shanghai/C60/2007、A/Duck/Shanghai/C163/2009和A/Duck/Shang hai/C164/2009分別由本實驗室于2007年和2009年從上海市的健康鴨群中分離、鑒定；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；H9熒光RT- PCR試劑盒由深圳匹基生物工程股份有限公司提供；新城疫陽性血清和禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；病毒核酸提取試劑盒為QIAamp Viral RNA Mini Kit；AMV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑均購自寶生物(大連)工程公司；特異引物由寶生物(大連)工程公司合成。

1.2 病毒的初步鑒定首先對鴨氣管和泄殖腔棉拭樣品用H9熒光RT-PCR試劑盒進行檢測，將陽性樣品處理后接種雞胚尿囊腔，分離毒尿囊液應用β-微量法進行HA試驗，以檢測其血凝性及HA效價。根據(jù)測得的HA效價，將分離毒尿囊液配制成4單位的溶液，用新城疫病毒陽性血清、AIV H5和H9陽性血清進行HI試驗，詳細步驟按照GB/T 18936-2003 高致病性禽流感診斷技術(shù)。

1.3 基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列，對8個基因片段進行了引物的設(shè)計及合成，用病毒RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，具體步驟按照說明書進行。RT-PCR產(chǎn)物電泳經(jīng)凝膠回收后，按pMD18-T載體說明書進行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoR I和Hind III進行雙酶切鑒定；鑒定為陽性克隆后送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.4 基因cDNA核苷酸序列及推導的氨基酸序列分析比較借助DNAStar4.0分析軟件，通過Jotun Hein方法分析比較所得序列的同源性以及一些關(guān)鍵位點的變化情況。

1.5 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹借助MEGA3.1分析軟件，確定這3個毒株8個基因的遺傳分類情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒的初步鑒定結(jié)果A/Duck/Shanghai/C60/2007、A/Duck/Shang hai/C163/2009和A/Duck/Shanghai/C164/2009感染的雞胚尿囊液血凝性能夠被H9型AIV陽性血清所抑制，而不能被H5型AIV陽性血清和新城疫陽性血清所抑制，表明這3株病毒均為H9亞型。

2.2 一些關(guān)鍵位點的分析通過對NA基因的測序表明A/Duck/Shanghai/C60/2007、A/Duck/Shanghai/C163/2009和A/Duck/Shanghai/C164/2009均為H9N2亞型。這3株鴨H9N2亞型AIV的全基因序列在GenBank的登錄號為KC768039～KC768062。3株H9N2亞型AIV HA和NA基因片段與參考株最高同源性比較詳見表1。通過對裂解位點的分析表明，這3株鴨H9N2 AIV均為低致病性禽流感。其226位均為Leu，表明有向哺乳動物感染的趨勢。HA基因關(guān)鍵位點的分析詳見表2。

表1 3株H9N2亞型鴨禽流感病毒HA和NA基因片段與參考株最高同源性比較Table 1 Genetic homology of HA and NA gene from the three H9N2 subtyte Avian influenza virus isolates in Shanghai from the ducks with related sequences available in GenBank

表2 3株H9N2亞型禽流感病毒HA基因幾個關(guān)鍵位點的比較Table 2 Comparison of several key sites of HA gene from three H9N2 subtpe Avian infl uenza virus isolates

2.3 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹借助MEGA3.1分析軟件，建立這3株H9N2亞型AIV的HA和NA基因進化樹（圖1）。這3株H9N2亞型AIV的HA均屬于Ck/Bei (A/Chicken/Beijing/1/1994）系，與疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken于同一個系，但是與這2株疫苗株之間的遺傳距離均大于7.0%。通常認為，當流感病毒HA1亞單位遺傳距離超過7.0%時，就需要更新相應的疫苗毒株[3]。這3株H9N2亞型AIV的NA基因與這2株疫苗株也均屬280/1997)系。

圖1 上海市3株鴨H9N2亞型禽流感病毒的HA和NA基因進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of the HA and NA genes of three H9N2 AIV isolates from the ducks in Shanghai

2.4 三株分離株的內(nèi)部基因片段的遺傳衍化關(guān)系對這3株分離株的內(nèi)部基因片段進行了基因進化分析（圖略），這3株鴨H9N2流感病毒的基因分型情況如表3所示。2007年分離的1株H9N2毒株其PB1基因與Ck/Bei同屬一個基因群，而2009年分離的2株H9N2毒株其PB1基因與Gs/GD(A/Goose/Guangdong/1/1996)同屬一個基因群，其余基因片段均在同一個基因群中。

表3 3株H9N2亞型禽流感病毒分離株的基因分型Table 3 The genotypes of three H9N2 subtype Avian infl uenza virus islates

3 討論

由于哺乳動物（包括人類）與家禽接觸的機會較多，特別是農(nóng)村以及家禽養(yǎng)殖場，這使流感病毒在人、家禽、豬體之間循環(huán)，加之2003年香港發(fā)生H9N2亞型AIV感染人的疫情，對人類直接構(gòu)成威脅，使得人們對H9N2亞型禽流感的公共衛(wèi)生學意義愈來愈重視。研究發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV在鴨體內(nèi)復制和排毒的時間可達30 d[4]。水禽一直被認為是A型流感病毒的基因庫[5-7]?？绶N間傳播常常由水禽傳播到陸生禽類或哺乳動物，例如豬、馬甚至人類。這些跨種間傳播在自然界中建立了非常復雜的生態(tài)學系統(tǒng)。鴨、鵝等水禽不僅可通過間接方式將H9N2亞型AIV傳播給人，而且還能夠作為AIV變異、重組的混合器。由于在水禽體內(nèi)幾乎都可分離到H9N2亞型AIV，這些病毒可能在水禽體內(nèi)與其他亞型發(fā)生重組，改變其抗原和宿主特異性，很可能產(chǎn)生對人高感染力的流感病毒，給人類健康帶來危害。流感病毒基因流向通常被認為是從水禽向別的動物種類，這個觀點阻礙了我們對整個流感生態(tài)系統(tǒng)的理解。2000年至2001年從中國南方的家鴨中分離到的H9N2流感病毒，對它們抗原性和基因分析表明：20世紀90年代在雞和鵪鶉中建立的H9N2流感病毒基因型已經(jīng)又返回到家鴨中，和鴨中已存在的流感病毒雜交產(chǎn)生了二重體或三重體[8]，研究表明在陸地禽和水禽之間發(fā)生著雙向傳播，這些重組體進一步向其他宿主跨種間傳播也會隨之發(fā)生。

本研究中2007年分離的鴨H9N2毒株P(guān)B1基因與Ck/Bei同屬一個基因群，而2009年分離的2株鴨毒株P(guān)B1基因與Gs/GD同屬一個基因群，表明H9N2病毒與其他亞型毒株已發(fā)生了重組。根據(jù)對受體結(jié)合位點的分析，本研究中的3株鴨H9N2流感病毒重組體有向人類感染的嗜性[9,10]，通過對裂解位點的分析表明，這3株鴨H9N2病毒均為低致病性禽流感。低致病性禽流感更容易廣泛傳播，易于獲得感染人或有助于人之間傳播的基因片段[11]，這樣的情形會增加新型流感大流行的風險。通過計算與疫苗株之間的遺傳距離，提示現(xiàn)有疫苗對分離毒株的保護效果值得進一步研究。本文對鴨H9N2流感病毒分子遺傳規(guī)律等方面研究，也為鴨源H9N2亞型禽流感疫情的防制提供了理論和試驗依據(jù)。

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PHYLOGENETIC ANALYSIS OF THREE H9N2 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS ISOLATES FROM DUCKS IN SHANGHAI

GE Fei-fei,LIU Jian,YANG De-quan,JU Hou-bin,GE Jie,ZHOU Jin-ping
(Shanghai Animal Disease Control Center ,Shanghai 201103,China)

To explore genetic variation of fi eld isolates of H9N2 subtype Avian infl uenza virus (AIV) and their genetic relationship with the vaccine strains (A/Chicken/Shandong/6/1996 and A/Chicken/Shanghai/F/1998),oropharyngeal and cloacal samples were collected from ducks in Shanghai in 2007 and 2009. These samples were tested for H9 subtype AIV in Real-time RT-PCR and then positive samples were inoculated into 10-day-old SPF chicken eggs for virus isolation. Three AIV isolates were obtained,one from the sample collected in 2007 and two from the samples collected in 2009. These three isolates were further identifi ed in HI test. As a result,three isolates were all AIV H9N2 subtype. Subsequently,cDNAs of eight gene segments of these isolates were amplifi ed in RT-PCR and sequenced for phylogenetical analysis as compared with the relevant sequences from GenBank. All three isolates were grouped into low pathogenic AIV as the cleavage site of their haemagglutinin (HA) was PARSSRGLF. Sequencing results showed that the three isolates belonged to the Ck/Bei sublineage based on HA and NS genes or to the same clade with A/Duck/Y280/1997 based on their NA genes. Additional phylogenetic analysis of their NP and PA genes revealed that they were in the same evolutionary branch with A/Goose/Guangdong/1/1996(H5 subtype) while PB2 and M genes belonged to Qa/HK/G1/97 lineage. However,the genetic origin of PB1 gene from the isolate of 2007 was different from two isolates of 2009. The genetic distances between these three isolates and the vaccine viruses (A/Chicken/Shandong/6/1996 and A/Chicken/Shanghai/F/1998) were more than 7%. The results from the present study suggested that these three duck H9N2 subtype isolates might have emerged through natural gene reassortment among AIVs with different sublineages.

H9N2 subtype Avian infl uenza virus; phylogenetic analysis; genetic distances

S852.659.5

A

1674-6422（2014）05-0015-06

2014-03-07

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（2007(3-4)）；上海市科委生物醫(yī)藥重大專項（09DZ1906602）

葛菲菲，女，博士，主要從事分子生物學檢測與病毒基因變異研究

周錦萍，E-mail：shzjpvet @163.com