柴芍承氣湯對(duì)大鼠腸缺血再灌注后腸組織半胱氨酰白三烯受體1的表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響

吳深寶　洪小飛　朱旭星　童秀萍　王園園

柴芍承氣湯對(duì)大鼠腸缺血再灌注后腸組織半胱氨酰白三烯受體1的表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響

吳深寶洪小飛朱旭星童秀萍王園園

【摘要 】目的研究中藥柴芍承氣湯對(duì)大鼠腸缺血再灌注（I/R）損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法30只大鼠分為3組，對(duì)照組、模型組和中藥組各10只。通過免疫組織化學(xué)染色方法、Western blot和RT-PCR法檢測大鼠腸組織半胱胺酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）蛋白和mRNA表達(dá)水平，并用光學(xué)顯微鏡觀察小腸病理改變，檢測小腸重量變化，TUNEL方法檢測小腸黏膜細(xì)胞凋亡。結(jié)果 （1）與對(duì)照組比較，中藥組大鼠腸組織的病理改變均明顯減輕（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，模型組小腸含水量明顯增加（P＜0.05），而中藥組小腸含水量顯著降低（P＜0.01）；（2）腸I/R時(shí)腸組織CysLTR1蛋白和mRNA表達(dá)水平升高；應(yīng)用中藥后，腸組織CysLTR1蛋白和mRNA表達(dá)水平均減低（均P＜0.05）；（3）與模型組比較，中藥組小腸黏膜細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.01）；（4）小腸黏膜中CysLTR1蛋白表達(dá)分別與細(xì)胞凋亡、黏膜病理損傷、小腸含水量呈正相關(guān)（r=0.8463、0.8783、0.7708，均P＜0.05）。結(jié)論柴芍承氣湯能減輕腸I/R腸組織的病理損害和降低小腸黏膜細(xì)胞凋亡，并能抑制腸黏膜組織CysLTR1的表達(dá)，CysLTR1的表達(dá)可能是柴芍承氣湯保護(hù)腸黏膜損傷的靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】大鼠腸缺血再灌注柴芍承氣湯胱氨酰白三烯受體1凋亡

半胱氨酰白三烯受體（cysteinyl leukotrienes，CysLT-sR）介導(dǎo)平滑肌痙攣、微血管滲漏等反應(yīng)，參與炎癥、哮喘、腦腎缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷、腫瘤和休克等多種炎癥病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，通腑瀉下的復(fù)方中藥對(duì)腸道黏膜屏障功能有保護(hù)作用。目前國內(nèi)外對(duì)于復(fù)方中藥是否通過CysLTs/CysLTsR途徑保護(hù)腸缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）腸損傷的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道罕見。本研究將傳統(tǒng)中藥柴芍承氣湯用于I/R大鼠腸損傷模型，檢測腸組織CysLTsR1的表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡，探討柴芍承氣湯對(duì)腸I/R的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1　材料和方法

1.1試劑Rabbit polyclonal to CysLTR1 Antibody購自美國Abam公司，SP免疫組化染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；高純總RNA快速提取試劑盒購自上海Generay公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit購自立陶宛Fermentas公司；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自美國Bio-Rad公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2動(dòng)物分組及模型的制作30只雄性Wistar大鼠，體重（320±30）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK-（軍）2007-004]。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組、模型組和柴芍承氣湯中藥組，每組10只。I/R模型制作方法如下：實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水。術(shù)前1h中藥組柴芍承氣湯1次性灌胃給藥（劑量5ml/kg體質(zhì)量），對(duì)照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹部皮膚備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，上腹部沿正中線切一長4～6cm切口，暴露腸系膜前動(dòng)脈，距其根部約0.5～0.8cm，游離約0.4～0.6cm腸系膜前動(dòng)脈，對(duì)照組不夾閉血管，模型組和中藥組用小動(dòng)脈夾夾閉，45min后松開腸系膜前動(dòng)脈夾。在腸系膜前動(dòng)脈夾閉期間，3組均間斷地向腹腔內(nèi)注射約15～20ml/kg 0.9%氯化鈉溶液，關(guān)腹后再向腹腔內(nèi)追加25～30ml/kg 0.9%氯化鈉溶液（內(nèi)含5萬U青霉素鈉），以達(dá)到既擴(kuò)容又預(yù)防腹腔操作時(shí)污染的目的。術(shù)畢放回鼠籠飼養(yǎng)觀察。一鼠一籠，自由進(jìn)食、飲水。造模過程中及造模后各組大鼠均未死亡,存活率100%。再灌注90min后處死大鼠。

1.3柴芍承氣湯的制作組成如下：柴胡10g，白芍10g，黃芩10g，枳實(shí)10g，厚樸10g，玄明粉（沖）10g，生大黃（后下）10g。前5味中藥用溫水浸泡0.5h后，加水200ml后開始加熱，至中藥煮沸18min后熄滅熱源，此時(shí)湯液量為110ml左右，將生大黃加入浸泡2min，之后倒出湯液，再加入玄明粉，冷卻后即可使用。

1.4標(biāo)本的制作和觀察截取部分小腸組織，距離盲腸10～20cm處剪取末端回腸組織2cm，PBS緩沖液沖凈內(nèi)容物，截取3段分別用10%中性甲醛溶液固定、-80℃凍存和計(jì)算小腸含水量。取部分小腸標(biāo)本，用電子天平稱量小腸濕重，置90℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤72h，稱干重，小腸含水量=（組織濕重-組織干重）/組織濕重×100%。取約1cm末端回腸用0.9%氯化鈉溶液漂洗，然后常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，切片后用HE染色。按操作步驟常規(guī)進(jìn)行脫蠟、脫苯、染色、脫水、透明、封片，然后觀察并拍照，觀察大鼠小腸病理損傷。病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]：小腸黏膜損傷以Chiu’s分級(jí)為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。0為正常小腸黏膜絨毛；1為在絨毛中軸出現(xiàn)腸黏膜上皮下的Gruenhagen’s間隙，常常伴隨毛細(xì)血管充血；2為來自固有膜的腸黏膜上皮抬高以及腸上皮下間隙的擴(kuò)張；3為大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側(cè)倒伏，部分絨毛頂端脫落；4為絨毛及固有膜脫落，裸露的毛細(xì)血管擴(kuò)張，可看到固有膜細(xì)胞成分構(gòu)成增加；5為固有膜蛻變或被消化，出血或潰瘍形成。

1.5免疫組化檢測缺血再灌注大鼠腸組織中CysLTR1的表達(dá)嚴(yán)格按照SP免疫組化染色試劑盒操作步驟。結(jié)果判定：在100倍鏡下，隨機(jī)選取8～10個(gè)陽性表達(dá)視野，使用Image-Pro-Plus軟件進(jìn)行平均光密度掃描。

1.6 Western blot檢測I/R大鼠腸組織中 CysLTR1的表達(dá)將組織剪成細(xì)小的碎片，按每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000g離心15min，取上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10min后離心取上清液上樣，將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液電泳分離蛋白，當(dāng)染料到達(dá)膠底部時(shí)切斷電源，停止電泳，進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1h或 4℃過夜。根據(jù)說明書 CysLTR1 1∶500、GAPDH 1∶1 500稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2h或4℃孵育過夜。孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據(jù)用量，按照1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5min。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。暗室中打開紅外燈，取出感光膠片做好標(biāo)記，輕輕放在膜上，顯色30～60s，拿開膠片立即完全浸入顯影液中1～2min，在放入定影液中1min，離開暗室觀察結(jié)果?？梢愿鶕?jù)條帶強(qiáng)弱再次感光或減短感光時(shí)間達(dá)到理想結(jié)果。

1.7 RT-qPCR法測定CysLTR1mRNA和5-LOXmRANA水平Trizol-離心柱法提取細(xì)胞總RNA。RNA純度的測定和RNA的定量以相應(yīng)溶劑為對(duì)照（Blank），取2μl RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續(xù)RT-qPCR所需。根據(jù)Genbank設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：RAT Actin Forward：CCCATCTATGAGGGTTACGC，RAT Actin Reverse：TTTAATGTCACGCACGATTTC，PCR產(chǎn)物大小為150 bp；RAT CysLTR1 Forward：TGCCATATCATATTCAACGAGC，RAT CysLTR1 Reverse：AGCAGAGGATCAAAGCAACAA，PCR產(chǎn)物大小為142bp；將反應(yīng)液加入384孔板內(nèi)，封膜后，將384孔板置入7900HT熒光定量PCR儀中，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光定量，95℃1min；95℃15s，60℃60s，95℃15s，40個(gè)循環(huán)；60℃15s，95℃15s。熒光定量數(shù)據(jù)分析采用參照基因的△Ct法計(jì)算每個(gè)樣本目的基因的表達(dá)值，為了對(duì)反應(yīng)體系中的基因擴(kuò)增進(jìn)行均一化處理，使用管家基因GAPDH作為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)值=2Ct（GAPDH）-Ct（目的基因）。

1.8腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的檢測采用TUNEL法，按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）說明書進(jìn)行操作。顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕褐色，組織塊400倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)，任意選擇3個(gè)視野，求其平均值。

2　結(jié)果

2.13組小腸含水量的比較與對(duì)照組[（78.13±1.35）%]相比，模型組大鼠腸含水量[（81.83±2.41）%]增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠腸含水量[（71.57±5.72）%]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.23組大鼠腸組織的病理學(xué)變化對(duì)照組：顯微鏡下觀察可見，腸組織由4層結(jié)構(gòu)組成，黏膜與黏膜下層向管腔內(nèi)突起，形成許多皺襞，黏膜下層無腺體，絨毛發(fā)達(dá)，排列緊密，無充血、水腫或炎細(xì)胞浸潤；肌層由2層平滑肌組成，漿膜外有脂肪組織，無明顯病變（病理評(píng)分2）。模型組：由4層結(jié)構(gòu)組成，黏膜下層絨毛皺縮，出血性壞死，可見明顯炎細(xì)胞浸潤；肌層厚度變薄，有出血灶（病理評(píng)分42）。中藥組：與模型組相比，絨毛皺縮程度有所減輕，可見明顯炎細(xì)胞浸潤；肌層無明顯病變（病理評(píng)分26），見圖1。與對(duì)照組比較，模型組腸損傷程度明顯嚴(yán)重（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組可明顯改善腸I/R引起的腸損傷（P＜0.05）。

2.3免疫組化觀察腸I/R動(dòng)物模型中CysLTR1表達(dá)在100倍高倍鏡下，隨機(jī)選取8～10個(gè)陽性表達(dá)視野，使用Image-Pro-Plus軟件進(jìn)行平均光密度掃描顯示：CysLTR1陽性表達(dá)模型組（0.161±0.023）較對(duì)照組（0.102±0.03）顯著增高（P＜0.05）；中藥組 CysLTR1陽性表達(dá)（0.124±0.102）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），低于模型組（P＜0.05），見圖2。

圖1　3組大鼠腸組織病理切片（A：對(duì)照組；B：模型組；C：中藥組；HE染色，×250）

圖2　3組大鼠腸組織免疫組化結(jié)果（A：對(duì)照組；B：模型組；C：中藥組；免疫組化染色，×100）

2.4Western blot觀察腸I/R動(dòng)物模型中CysLTR1表達(dá)結(jié)果顯示對(duì)照組CysLTR1弱表達(dá)（24.19±3.68）%，模型組肝組織CysLTR1表達(dá)（80.32±7.54）%較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組（58.10± 6.98）%與模型組比較，可顯著降低CysLTR1表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.5RT-qPCR法測定腸I/R動(dòng)物模型中CysLTR1mRNA表達(dá)結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組CysLTR1mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組顯著降低CysLTR1mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。

圖3　Western blot檢測CysLTR1表達(dá)

2.6腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕褐色，根據(jù)陽性細(xì)胞分布情況，各個(gè)組別每個(gè)組織塊400倍鏡下選擇3個(gè)陽性視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)。對(duì)照組凋亡指數(shù)（12.11± 3.89），模型組腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)（33.33±6.76）顯著升高（P＜0.05），中藥組（12.00±4.58）可顯著減少I/R引起的黏膜細(xì)胞凋亡（P＜0.01），見圖4。

圖4　TUNEL檢測腸黏膜細(xì)胞凋亡（A：對(duì)照組；B：模型組；C：中藥組；×250）

2.7 小腸黏膜病理損傷、小腸含水量、細(xì)胞凋亡和CysLTR1蛋白表達(dá)的關(guān)系小腸組織的CysLTR1蛋白免疫組化積分與小腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)和黏膜損傷程度呈顯著正相關(guān)（r=0.8463、0.8783，P＜0.01）；小腸組織的CysLTR1蛋白免疫組化積分與小腸含水量呈顯著正相關(guān)（r=0.7708，P＜0.05）。

3　討論

腸I/R是臨床常見的病理生理過程，是小腸移植的最大障礙。出血性休克、嚴(yán)重?zé)齻麆?chuàng)傷、器官移植、腸系膜血管栓塞和外科急危重病均可引起腸I/R的發(fā)生。如何減輕腸I/R損傷是臨床上的重點(diǎn)難點(diǎn)之一。據(jù)報(bào)道，柴芍承氣湯是在大承氣湯(由大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝4藥組成)基礎(chǔ)上加柴胡、白芍、黃芩組成，作用于重癥胰腺炎的多個(gè)環(huán)節(jié)，在恢復(fù)胃腸道運(yùn)動(dòng)、抑制炎性細(xì)胞因子、抑制炎性介質(zhì)、減輕中性粒細(xì)胞浸潤、抗炎和改善胰腺缺血方面均有相互增強(qiáng)作用，并下調(diào)急性壞死性胰腺炎時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡、改善腸道屏障功能，可柴芍承氣湯對(duì)腸I/R損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制目前文獻(xiàn)報(bào)道極少。

柴芍承氣湯對(duì)小腸含水量、腸黏膜病理損害的影響。研究發(fā)現(xiàn)柴芍承氣湯在減輕胰腺損傷、防止腸黏膜萎縮、促進(jìn)腸道功能恢復(fù)等方面具有積極的作用。研究通過大鼠腸I/R模型，在I/R時(shí)小腸含水量增加明顯，而應(yīng)用中藥后，小腸含水量減少，提示中藥可減少腸I/R引起的液體滲出；顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大鼠I/R時(shí)，黏膜下層絨毛皺縮，出血性壞死，可見明顯炎細(xì)胞浸潤；肌層厚度變薄，有出血灶，表明腸I/R可引起腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞。另外，在I/R時(shí)小腸含水量增加明顯，而應(yīng)用中藥后，發(fā)現(xiàn)腸道損傷程度有所減輕，表現(xiàn)為絨毛皺縮程度有所減輕，絨毛變寬，肌層無明顯改變。這說明中藥對(duì)腸I/R損傷有保護(hù)作用。

大鼠I/R腸組織中CysLTR1表達(dá)在腎、肝、膀胱和腸I/R損傷中起著重要作用[3-7]。CysLTs可提高血管滲透性、引起中性粒細(xì)胞浸潤和引起炎癥細(xì)胞因子釋放[8-9]。研究認(rèn)為I/R誘導(dǎo)的損傷是中性粒細(xì)胞依賴的，由此推測CysLTR1受體拮抗劑pranlukast對(duì)I/R的保護(hù)作用至少部分是通過阻滯CysLTR1減少炎癥反應(yīng)，如減少中性粒細(xì)胞的浸潤[10-11]。有研究顯示用pranlukast可減輕吲哚美辛引起的腸黏膜損害程度，并呈劑量依賴性[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸I/R模型組CysLTR1蛋白和mRNA水平表達(dá)均明顯升高，并且隨著CysLTR1蛋白免疫組化積分的增高，小腸病理損傷程度加重，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，提示CysLTR1參與了腸I/R引起的腸組織損傷過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用柴芍承氣湯后的大鼠腸組織的CysLTsR1蛋白和mRNA表現(xiàn)明顯減弱，而相應(yīng)的病理損傷程度也減輕，表明中藥可通過抑制腸組織CysLT-sR1的表達(dá)，從而起到對(duì)腸I/R損傷的保護(hù)作用。

多項(xiàng)研究表明，CysLTR1的表達(dá)與細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系，CysLTR1的特異受體拮抗劑孟魯司特和pranlukast可抑制CysLTR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16-19]。本研究發(fā)現(xiàn)CysLTR1的表達(dá)越強(qiáng)，腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)越大，兩者相關(guān)關(guān)系也表明兩者呈正相關(guān)，表明CysLTR1的表達(dá)除了上述機(jī)制引起腸組織損傷外，同腸黏膜細(xì)胞凋亡也有一定關(guān)系。

腸黏膜上皮穩(wěn)定的維持，依賴于上皮細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡。柴芍承氣湯能夠顯著下調(diào)腸I/R模型大鼠的腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。我們研究也發(fā)現(xiàn)，隨著腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)的降低，小腸含水量也顯著減少，證實(shí)腸黏膜細(xì)胞凋亡與腸道通透性相關(guān)。有趣的是在本研究中，大鼠受中藥干預(yù)后，凋亡指數(shù)與對(duì)照組無顯著差異，而含水量顯著低于對(duì)照組，提示中藥除了抑制腸黏膜細(xì)胞凋亡外，還可能通過免疫功能和水通道蛋白的調(diào)節(jié)減少腸道通透性[20-21]。

總之，柴芍承氣湯可以減輕腸I/R對(duì)腸組織的損傷，抑制腸黏膜細(xì)胞網(wǎng)凋亡，其機(jī)制可能是通過或部分通過抑制腸組織CysLTR1的表達(dá)而起作用。

4　參考文獻(xiàn)

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-06-24）

基金項(xiàng)目：浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金（2012ZYC-A87）作者單位：322000義烏，溫州醫(yī)學(xué)院附屬義烏醫(yī)院消化科通信作者：吳深寶，E-mail：wushengbao100@163.com

Protective effect of Chinese traditional medicine Chaishao Chengqi Decoction on intestinal ischemia-reperfusion injury and its mechanisms in rats

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of????????????Decoction on intestinal ischemia-reperfusion(I/R)injury and its mechanisms in rats.MethodsThirty rats were divided into 3 groups:sham operation group,I/R model group and treatment group with 10 in each.The expression of CysLTR1 protein and mRNA levels in intestinal tissue was detected by immunohistochemical staining，Western blot and RT-PCR,respectively;pathological changes of small intestine were observed with optical microscopy;the weight changes of small intestine were measured;and the apoptosis of intestinal mucosa was detected with TUNEL method.ResultsCompared with the model group,pathological changes of intestinal tissue in treatment group were attenuated significantly(P＜0.05).Intestinal water content in model group was significantly higher than that in sham operation group and treatment group(P＜0.01).The expression levels of CysLTR1 protein and mRNA were increased in model group,and decreased in treatment group.Compared with the model group,apoptosis index of intestinal mucosa cells in treatment group was significantly decreased(P＜0.01).The expression of CysLTR1 protein in the intestinal mucosa was correlated with cell apoptosis,pathological changes of mucosal injury and intestinal water content(r=0.8463,0.8783,0.7708,respectively,all P＜0.05).Conclusion????????????￥Decoction can alleviate the pathological changes of intestinal tissue and decrease the cell apoptosis induced by I/R,which is associated with the inhibition of CysLTR1 expression in intestinal mucosa of rats.

【Key words】RatIntestinal ischemia reperfusionChaishao Chengqi DecoctionCysteinyl leukotriene receptor 1 Apoptosis