固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析石菖蒲中揮發(fā)油成分

都姣嬌, 杜安妮

（1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 北京 100039； 2.遵義醫(yī)學院, 貴州 遵義 563003）

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析石菖蒲中揮發(fā)油成分

都姣嬌1, 杜安妮2

（1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 北京 100039； 2.遵義醫(yī)學院, 貴州 遵義 563003）

目的 研究固相微萃取法提取石菖蒲中的揮發(fā)油，并鑒定其揮發(fā)油的組成成分。方法 優(yōu)化固相微萃取條件，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對石菖蒲的揮發(fā)油進行成分鑒定并確定各成分的相對質(zhì)量分數(shù)。 結(jié)果 采用固相微萃取法共提取出 33 個可鑒定成分， 其中含有量較高的主 要成分分別為 α-細辛 腦 （66.07%）、 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯（3.63%）、 欖香素 （2.65%）、 畢橙茄烯 （2.90%） 等。 結(jié)論 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能快速、 全面檢測石菖蒲揮發(fā)油的主要成分，為其進一步研究提供了依據(jù)。

石菖蒲; 揮發(fā)油; 固相微萃取; 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根， 其味辛性溫， 具芳香之氣， 行 散之力較強， 為宣氣通 竅之佳 品［1］。 臨床上主要 用于熱 病神昏、癲狂、痰厥、健忘、癡呆、耳聾、耳鳴、心胸煩悶、跌打損傷等［2］。 近年來研究發(fā)現(xiàn)， 揮發(fā)油是石菖蒲鎮(zhèn)靜、催眠、 抗驚厥［3］作用的主要有效部位， 而細辛醚又是其主要活性成分［4］。 α-細辛醚具有解痙、 抗驚厥和對戊巴比妥鈉有協(xié)同等作用; 更有文獻報道， β-細辛醚具有平衡大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制的雙重作用，有利于穩(wěn)定臨床癲癇病人的病情［5-6］。

對石菖蒲揮發(fā)油成分分析的文獻報道大都集中在水蒸氣蒸餾提取法和超臨界二氧化碳流體萃取 （SFE-CO2）法［7-8］， 未查詢到關(guān)于用固相微萃取-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用研究石菖蒲揮發(fā)油的相關(guān)報道。 固相微萃取 （SPME） 的最大特點就是集取樣、萃取、富集、進樣于一體，因而操作簡便，并且不需溶劑，萃取速度快、操作成本低、不污染環(huán)境、便于實現(xiàn)自動化［9-10］。 本實驗采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （SPME-GC-MS） 技術(shù)對石菖蒲揮發(fā)油成分進行分析鑒定，以期對其今后的相關(guān)研究提供參考。

1 儀器和試劑

手動固相微萃取裝置 （ 美國 Supelco公司）;HP-1510氣相色譜頂空加熱器 （上海濟成分析儀器有限公司）; 萃取纖維頭分別為 100 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS）、 7 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS）、 聚丙烯酸酯 （PA）; 6890-5973N氣 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀 （ 美 國 Agilent公 司 ） ; AL 204 電子天平 （ Mettler Toledo公司） ;JS-05 多功能粉碎機 （浙江武義捷順工具有限公司）。

石菖蒲購自遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地四川，經(jīng)遵義醫(yī)學院楊建文副主任藥師鑒定為石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根。

2 實驗方法

2.1 固相微萃取提取揮發(fā)油 將石菖蒲置于 45 ℃烘箱中烘至恒定質(zhì)量、 粉碎、 過 60 目篩。 稱取 0.4 g石菖蒲粉末置于 5mL樣品瓶中， 蓋上瓶蓋， 在 120 ℃下平衡 20 min。萃取頭使用前應(yīng)先進行高溫活化。將纖維頭接上手柄后，萃取器插入樣品瓶中，露出石英纖維進行萃取，相同溫度下頂空萃取 25 min， 然后將石英纖維退入針頭， 拔出萃取器， 立即將萃取器插入 GC進樣口 （溫度 260 ℃）， 露出石英纖維進行脫附， 解吸 2 m in， 最后石英纖維退入針頭， 拔出萃取器。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 色譜條件 程序升溫， 初始溫度 50 ℃， 以 5 ℃/ min 的升溫速率升至 125 ℃， 保持 2 min， 然后以 1 ℃ /min的升溫速率升至 140 ℃， 最后以 9 ℃/min 的升溫速率升至230 ℃， 保持 5 min; 汽化室溫度 260 ℃;Agilent HP-5MS色譜柱 （ 30m×0.25 mm×0.25 μm）; 載氣為高純氦氣，體積流量 1.0mL/min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 四極桿溫度150 ℃; 電離方式 EI， 電子能量 70 eV; 離子源溫度 230 ℃; 溶劑延遲 4.0 min; 質(zhì)量掃描范圍 m/z30 ～500。

設(shè)定積分參數(shù)初始峰寬為 0.080， 初始閾值為 16.0，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對質(zhì)量分數(shù)，利用美國 Wiley7Nist05、 NIST05 兩種 質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫 的 質(zhì) 譜數(shù)據(jù)進行計算機檢索比對， 對質(zhì)譜圖相似度大于 80%的化合物進行收集整理。

3 結(jié)果

3.1 固相微萃取條件的選擇

3.1.1 纖維頭選擇 選擇 100 μm聚二甲基硅氧烷涂層（PDMS） 纖維頭和 7 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS） 纖維頭以及聚丙烯酸酯 （PA） 纖維頭進行考察， 按 “2.1”項所述實驗步驟，以檢測出的總峰面積和峰個數(shù)作為衡量指標， 在相同積分參數(shù)條件下， 100 μm PDMS 共檢出56 個峰， 總峰面積為 1.008 ×109;7 μm PDMS 共檢出 4 個峰，總峰面積為 5.237 ×107;PA共檢出 31 個峰， 總峰面積為5.228 ×108。 結(jié)果證明， 100 μm PDMS 萃取頭所得的峰面積總和及峰個數(shù)最大，說明其能夠更有效地吸附石菖蒲中的揮發(fā)性成分， 因此選用 100 μm PDMS 纖維頭。

3.1.2 樣品用量選擇 分別選用 0.2、 0.4、 0.6、 0.8 g樣品粉末試驗，考察色譜峰總面積和峰個數(shù)，在相同積分參數(shù)條件下， 結(jié)果見圖 1。 結(jié)果表明， 樣品用量變化時， 各種待測成分的峰面積變大或變小，而待測成分種類沒有很大影響。 樣品用量為 0.4 g時， 所得峰總面積已經(jīng)達到最大，且峰分離度好、不拖尾。

圖1 樣品用量對總峰面積的影響

3.1.3 平衡時間選擇 保持其他條件不變， 改變樣品平衡時間從 15 min 延 長 至 35 min， 考 察 平衡 時 間 與總 峰 面積的關(guān)系。設(shè)定相同的積分參數(shù)條件，結(jié)果見圖2。當平衡時間為 20 m in 時， 總峰面積達到最大， 之后隨著時間的延長， 總峰面積有所減少， 說明 20 min 樣品已達到考察條件內(nèi)的最大值。 因此選擇 20 min 為樣品最適宜平衡時間。

圖2 平衡時間對總峰面積的影響

3.1.4 萃取溫度選擇 分別選擇 60 ～130 ℃ （每 10 ℃為一個溫度梯度）作為參照，以色譜峰總面積和峰個數(shù)作為考察指標，結(jié)果見圖 3。結(jié)果表明，隨著萃取溫度的上升， 總峰面積也隨之增加， 當?shù)竭_ 120 ～130 ℃時， 總峰面積達到動態(tài)平衡。并且考慮到萃取溫度太高，萃取頭的吸附量較大， 記憶效應(yīng)也較大， 故選擇 120 ℃為最適宜萃取溫度。

3.1.5 萃取時間選擇 實驗選定 10、 15、 20、 25、 30、35 min 萃取時間進行檢測分析， 以色譜峰總面積和峰個數(shù)作為考察指標， 實驗結(jié)果見曲線圖 4。 隨著萃取時間的延長， 總峰面積也隨之增加， 當萃取時間為 25 min 時達到最大值，之后總峰面積基本不變，說明此時分析組分的吸附與解析已達到平衡。 因此， 選擇 25 min 作為最佳萃取時間。

圖3 萃取溫度對總峰面積的影響

圖4 萃取時間對總峰面積的影響

3.1.6 解吸時間選擇 萃取頭吸附樣品之后插入氣相色譜進樣口進行解吸，若解吸時間過短，可能導致解吸不完全，會產(chǎn)生記憶效應(yīng)，影響下一次測定;若解吸時間過長則會使進樣時間變長，色譜峰則會變寬。合適的解吸時間能夠保證萃取纖維上被富集吸附的待測成分更完全地解吸，防止在纖維涂層上殘留。 選定 1、 2、 3 min 進行解吸分析，實驗結(jié)果表明， 2 m in 即可解吸完全。

3.2 重復(fù)性試驗結(jié)果 按 “2.1” 項下操作條件下， 進行萃取進樣分析，重復(fù)6次，在相同積分參數(shù)條件下，以石菖蒲揮發(fā)油成分的總峰面積值為考察指標， 計算其 RSD，結(jié)果為 2.1%， 表明該方法重復(fù)性良好， 最佳萃取條件下的萃取量精確，適于石菖蒲揮發(fā)油成分的分析鑒定。

3.3 固相微萃取成分分析結(jié)果 最優(yōu)條件下固相微萃取得到的揮發(fā)油經(jīng) GC-MS 分析結(jié)果得到 34 個成分， 其相對質(zhì)量分數(shù)和為 86.99% （相似度 80%以上）， 總離子流圖見圖5， 成分分析結(jié)果見表 1。

圖5 固相微萃取石菖蒲揮發(fā)油總離子流圖

4 結(jié)論

固相微萃取法收集的成分能比較真實地反映中藥中的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，固相微萃取技術(shù)是集取樣、萃取、富集、進樣于一身， 大大縮短了操作時間 （一般只需 0.5 ～1 h），一定程度上提高了分析靈敏度。石菖蒲揮發(fā)油經(jīng)固相微萃取， GC-MS 分析， 共有 33 種成分得到有效分離， 相對質(zhì)量

分數(shù)和為 86.99%。 揮發(fā)油成分主要為結(jié)構(gòu)通式為 C15H24和C12H16O3的化合物及其衍生物， 其中相對質(zhì)量 分數(shù)較 高的有 α-細辛腦 （66.07%）， 細辛醚、 β-細辛醚均有鎮(zhèn)靜作用和抗驚厥作用， 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯 （3.63%）、 欖香素 （2.65%）、 畢橙茄烯 （2.90%） 等。 采用 SPME萃取石菖蒲揮發(fā)油， 最佳的萃取條件為 100 μm PDMS 纖維萃取頭萃取， 在 120 ℃下平衡 20min， 吸附 25min， 260 ℃下解吸附 2 min。 SPME-GC-MS 技術(shù)能全面、 快速地獲得其組成信息，重復(fù)性好，且操作時間短，樣品量小，無需萃取溶劑，可用于石菖蒲揮發(fā)油的快速檢測、分析。

表1 固相微萃取分析結(jié)果

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R284.1

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1001-1528（2014）12-2645-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.049

2013-09-02

都姣嬌 （1975—）， 女， 主管中藥師， 研究方向: 天然產(chǎn)物化學。 Tel:13717943795， E-mail:dujiaojiao1975@163.com