潛陽育陰顆粒含藥血清對 AngⅡ誘導 HUVEC損傷 NO的影響

王欣彤, 方祝元*, 嚴士海, 陳 藝, 張思奇

（1.江蘇省中醫(yī)院, 江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京 210029）

潛陽育陰顆粒含藥血清對 AngⅡ誘導 HUVEC損傷 NO的影響

王欣彤1, 方祝元1*, 嚴士海1, 陳 藝2, 張思奇2

（1.江蘇省中醫(yī)院, 江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京 210029）

目的 探討潛陽育陰顆粒 （鬼針草、 川牛膝、 山萸肉、 玄參、 制首烏、 澤瀉） 含藥血清對血管內皮損傷的作用。 方法 建立 AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡損傷模型， 采用 TBA法檢測 NO水平， Western blot法檢測 eNOS及 iNOS 蛋白表達， ELISA法檢測 NADPH氧化酶水平， 用 SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 結果 模型組 NO及 eNOS 蛋白表達較正常組降低， NADPH氧化酶則明顯升高; 纈沙坦組及潛陽育陰顆粒高劑量組 NO明顯升高， 且兩者之間有統(tǒng)計學組差異， 而潛陽育陰顆粒低劑量組則無顯著性差異; 纈沙坦組及潛陽育陰顆粒的 eNOS 蛋白表達顯著升高， NADPH氧化酶水平明顯下降; 各組 iNOS 表達差異不明顯。 結論 潛陽育陰含藥血清對 AngⅡ誘導體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞損傷具有類似纈沙坦樣的保護作用。

潛陽育陰顆粒; 纈沙坦; 人臍靜脈內皮細胞; 血管緊張素Ⅱ （AngⅡ）; 一氧化氮 （NO）

高血壓作為一種常見病，高發(fā)病，可引起心、腎等重要臟器的損害，嚴重危害人類健康。血管緊張素Ⅱ （Angiotensin Ⅱ， AngⅡ） 是腎素血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽，增加血管內皮還原型輔酶Ⅱ（NADPH） 氧化酶的表達和活性， 產生大量活性氧（ROS）， 誘導血管相關基因和蛋白改變， 抑制血管NO的 生 成，損 傷 血 管的 舒 縮 功能［1-2］。潛陽 育 陰顆粒是防治高血壓及其腎損害的有效院內制劑，動物研究證實其 對高血壓腎 損傷有 保護作 用［3-4］。 本次研究觀察潛陽育陰顆粒含藥血清對 AngⅡ誘導體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞 （HUVEC） 的影響，以探討該藥對血管內皮損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 HUVEC購自 ATCC公司，Number為 CRL-1730。

1.2 動物 雌性 SD大鼠 24 只， 體質量 （280 ± 20） g， 由南通大學實驗動物中心提供， 實驗動物生產許可證號:SCXK （蘇） 2008-0010。 大鼠飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號:SYXK （蘇） 2007-0017。

1.3 藥物 潛陽育陰顆粒， 由鬼針草、 川牛膝、山萸肉、 玄參、制首烏、 澤瀉組成， 加水10倍量，煎煮2次，收集藥液，濃縮，噴霧干燥，制成顆粒劑， 10 g/包， 由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供， 批號111103; 纈沙坦膠囊， 80 mg/粒， 由北京諾華制藥有限公司提供，批號 X1265。 均用蒸餾水配制。 潛陽育陰顆粒，10 g/（kg·d），100 g藥物加入 100 mL蒸餾水， 藥物劑量根據(jù)中藥藥理方法， 選用成人臨床劑量的10倍。

1.4 試劑及儀器 血管緊張素 II（human， SIGMA公司， SLBC0951V）; 酶標儀 （瑞士 TECAN公司，SUNRISE）;Human NADPH ELISA KIT （ R&D 公司， 20120702）;Western 電泳儀 （Bio-Rad， America， 164-5051）; 全 蛋 白 抽提試劑盒 （ KGP250）、Braford 蛋白定量檢測試劑盒 （KGA801）、 5 ×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液 （KGP101）、 SDS-PAGE凝膠 配 制 試 劑 盒 （ KGP113 ）、 WB 一 抗 稀 釋 液（KGP106）、 WB二抗稀釋液 （ KGP107）、 Western blot抗體清除緩沖液 （KGP110）、 ECL檢測試劑盒（KGP1123）、 二抗 （羊抗兔 IgG） （KGAA35）， 均由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供;NO檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所， 20120508）;紫外線分光光度計 （上海光譜儀器有限公司， SP-756PC）。

1.5 實驗方法

1.5.1 含藥血清制備 SD大鼠隨機分為正常組（等量蒸餾水）、 纈沙坦組 ［0.027 g/（ kg·d）］、潛陽育陰顆粒組 ［10 g/（kg·d）］， 每組 8 只。 灌胃給藥， 每日1 次， 連續(xù)6 d， 末次給藥后1 h， 頸總動脈采血， 3 000 r/min 離心 10 min， 取血清，56 ℃、 30 min 水浴滅活， 經 0.22 μm濾膜抽濾除菌， 分裝， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 體外培養(yǎng) HUVEC 細胞生長至 80%融合，棄去舊的培養(yǎng)液， PBS 輕輕蕩洗 2 次， 加入 2 mL 0.25%胰酶消化， 37 ℃溫育 2 min， 顯微鏡下見細胞圓縮、 間隙增大時， 立即棄去消化液， 用 PBS輕輕蕩洗 1 次， 加 入適量 含 10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液， 反復吹打，使之成為單個懸浮細胞， 分成 2 瓶， 37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.5.3 分組及干預方法 分別以 104～105的細胞計數(shù)量將細胞接種于 96 孔板和大約 105的細胞計數(shù)量將細胞接種于 6 孔板內培養(yǎng) 24 h。 分為 5 組，除正常組外， 其余組均采用 10-6mol/L AngⅡ作用于對數(shù)生長期的 HUVEC建立細胞凋亡損傷模型。造模后，取含藥血清，按組分別配制培養(yǎng)液進行干預: 正常組 （16%空白血清培養(yǎng)液， 16 mL空白血清 +84 mL不完全培養(yǎng)液）、模型組 （16%空白血清培養(yǎng)液，16 mL空白血清 +84 mL不完全培養(yǎng)液）、 纈沙坦組 （16%纈沙坦血清培養(yǎng)液， 16 m L纈沙坦血清 +84 mL不完全培養(yǎng)液）、 潛陽育陰顆粒低劑量組 （8%潛陽育陰顆粒血清培養(yǎng)液 +8%空白血清培養(yǎng)液， 8 mL潛陽育陰顆粒血清 +8 m L空白血清 +84 mL不完全培養(yǎng)液）、 潛陽育陰顆粒高劑量組 （16%潛陽育陰顆粒血清培養(yǎng)液， 16 mL潛陽育陰顆粒血清 +84 mL不完全培養(yǎng)液）， 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h［5］。 96 孔板按組取細胞上清放入離心管中， 編號后置于 -70 ℃冰箱保存待測;6 孔板內培養(yǎng)細胞用以 Western Blot和 RT-PCR檢測。

1.5.4 NO的檢測 從 -70 ℃液氮中取各組細胞上清標本、4℃冰箱中取出NO試劑盒，置于室溫平衡溶化。 采用硫代巴比妥酸 （TBA） 法，按照試劑盒內說明書進行檢測。

1.5.5 eNOS、 iNOS 蛋白的檢測 采用蛋白質印跡法 （ Western blot）［6-7］。

消化、洗滌6孔板內貼壁細胞后，進行蛋白樣本的提取制備、 Bradford 法蛋白定量、 SDS-PAGE、電泳、濕電轉移、封閉、抗體與靶蛋白的結合等處理，最后在暗室中曝光、顯影、洗像，保存顯示有目的條帶的膠片， 以 actin 為內參照， 應用圖象分析儀對條帶做掃描半定量。

1.5.6 NADPH氧化酶的檢測 從 -70 ℃液氮中取各組細胞上清標本、4 ℃冰箱中取出 NADPH氧化酶 ELISA試劑盒， 置于室溫平衡溶化。 采用酶聯(lián)免疫法 （ELISA法）， 按照試劑盒內說明書進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計，單因素方差分析， 結果用表示， 兩兩組間比較采用t檢驗。

2 實驗結果

2.1 潛陽育陰顆粒對 AngⅡ誘導 HUVEC損傷后NO水平的影響 結果顯示 （見表 1）: 與正常組比， 模型組 NO明顯降低 （P＜0.01）; 與模型組比，纈沙坦組及潛陽育陰顆粒高劑量組NO明顯升高 （P＜0.01）， 而潛陽育陰顆粒低劑量組則無顯著性差異 （P＞0.05）。

表1 各組 NO水平的比較 （）Tab.1 Comparison of NO content in each group（）

表1 各組 NO水平的比較 （）Tab.1 Comparison of NO content in each group（）

注: 與正常組比較，△△P＜0.01; 與模型組比較，**P＜0.01

組 別 劑 量 /（ g·kg-1） 例 數(shù) NO/（ μmol·L-1）6 146.73 ±11.86模型組 - 6 91.48 ±7.62△△纈沙坦組 0.027 6 140.79 ±12.28**潛陽育陰顆粒低劑量組 5 6 101.77 ±11.67潛陽育陰顆粒高劑量組 10 6 121.36 ±10.25正常組-**

2.2 潛陽育陰顆粒對 AngⅡ誘導 HUVEC損傷后eNOS、iNOS 蛋白表達的影響 結果顯示 （ 見表2、 圖 1）: 與正常組比， 模型組 HUVEC損傷后eNOS 蛋白表達明顯下降 （P＜0.05）; 與模型組比，予以潛陽育陰顆粒含藥血清干預后可不同程度提升 eNOS 蛋白表達 （P＜0.05，P＜0.01）; 纈沙坦也可顯著升高 eNOS 蛋白表達 （P＜0.01）。 各組iNOS 表達差異不明顯 （P＞0.05） 。

表 2 各組 eNOS及 iNOS蛋白表達的比較 （）Tab.2 Com parison of eNOS and iNOS protein expression in each group（）

表 2 各組 eNOS及 iNOS蛋白表達的比較 （）Tab.2 Com parison of eNOS and iNOS protein expression in each group（）

注: 與正常組比較，△P＜0.01; 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（ g·kg-1） 例 數(shù) （ eNOS/actin） （ iNOS/actin）0.48+0.04 - 3 0.45+0.09 0.46+0.06模型組 - 3 0.21+0.07△0.43+0.04纈沙坦組 0.027 3 0.44+0.02**0.45+0.08潛陽育陰顆粒低劑量組 5 3 0.34+0.03*0.47+0.03潛陽育陰顆粒高劑量組 10 3 0.52+0.04**正常組

2.3 潛陽育陰顆粒對 AngⅡ誘導 HUVEC損傷后NADPH氧化酶的影響 結果顯示 （見表 3）: 與正常組比， 模型組 NADPH氧化酶明顯升高 （P＜0.01）; 與模型組比， 予以纈沙坦、 潛陽育陰顆粒含藥血清干預后 NADPH氧化酶水平均明顯下降（P＜0.05）。

圖1 各組 NOS蛋白電泳圖Fig.1 NOS protein electrophoresis in each group

表3 各組 NADPH氧化酶的比較 （）Tab.3 Com parison of NADPH oxidase in each group（）

表3 各組 NADPH氧化酶的比較 （）Tab.3 Com parison of NADPH oxidase in each group（）

注: 與正常組比較，△△P＜0.01; 與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑 量 /（ g·kg-1） 例數(shù) NADPH/（ nmol·mL-1）- 6 97.75 ±16.13模型組 - 6 202.43 ±17.05△△纈沙坦組 0.027 6 165.56 ±4.74**潛陽育陰顆粒低劑量組 5 6 157.00 ±14.21**潛陽育陰顆粒高劑量組 10 6 120.13 ±10.13正常組**

3 討論

血管內皮細胞 （VEC） 是覆蓋在血管內腔表面的連續(xù)單層扁平細胞， 起屏障作用［8］。 它可分泌 NO、 AngⅡ等多種強效血管活性物質， 參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，血管內皮功能失調與許多心血管疾病特別是高血壓的發(fā)病有關。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基 （ROS） 和相關物質產生過多的一種狀態(tài)。目前已證實，氧化應激是發(fā)生高血壓的機制之一。 NADPH氧化酶是誘導機體產生 ROS 的主要活性酶， 而 AngⅡ是激活 NADPH氧化酶的最主要刺激因子［9-10］。 AngⅡ-NADPH 氧化酶-ROS 信號轉導途徑使血管內皮功能受損，血管內皮自身調節(jié)體系失衡，導致NO合成和釋放減少，內皮依賴性舒張功能下降，形成高血壓。因此本實驗應用 AngⅡ誘導 HUVEC凋亡損傷模型， 探討潛陽育陰顆粒的血管保護作用。

VEC是 NO的主要生成細胞。機體內的 NO由左旋精氨酸胍基末端的氮原子與分子氧在一氧化氮合成酶 （NOS） 催化合成。 NO生成后， 可快速擴散透過細胞膜，作用于鄰近靶器官，參與高血壓等病理生理過程。其中 NOS是生成 NO的關鍵環(huán)節(jié)。人體內存在3種一氧化氮合成酶亞型:分別為神經型 NOS （nNOS）、 誘導型 NOS （iNOS） 和內皮型NOS （eNOS）。 其中與高血壓密切相關的是 eNOS和 iNOS。 剔除 eNOS 基因的小鼠與正常小鼠相比，血壓 明 顯 升 高， 說 明 eNOS 的 表 達 與 高 血 壓有關［11］。

本研究顯示: 與正常組比， 模型組 NO及eNOS 蛋白表達明顯降低，與模型組相比， 纈沙坦組及潛陽育陰顆粒高劑量組NO明顯升高，而潛陽育陰顆粒低劑量組則無顯著性差異;予纈沙坦組及潛陽育陰顆粒干預后， eNOS 蛋白表達顯著升高;各組 iNOS 表達差異不明顯。 提示由 eNOS/NO途徑釋放的NO是血管中 NO的主要來源， 潛陽育陰顆粒在有效降壓的同時，可提高 NO的水平，且與劑量相關， 同時又可提高 eNOS 蛋白表達， 維持機體的穩(wěn)態(tài)。

NADPH氧 化 酶 是 生 成 ROS 的 主 要 酶 體。AngⅡ作為 RAS 的主要效應分子， 同時又是 NADPH氧化酶的刺激因子， 在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。臨床及實驗皆證實，高血壓與NO呈負相關、與 AngⅡ呈正相關， AngⅡ與 NADPH氧化酶呈正相關［12-14］。 本 研究表明， 模型組 NADPH氧化酶明顯升高，予纈沙坦組及潛陽育陰顆粒干預后 NADPH氧化酶水平明顯下降。 說明在高血壓狀態(tài)時，AngⅡ-NADPH 氧 化 酶-ROS 信 號 通 路 被激活， 抑制 eNOS 的表達， 抑制 NO的分泌， 導致血管內皮功能障礙，推測潛陽育陰顆?？梢砸种芅ADPH氧化酶活性， 從而發(fā)揮血管保護作用。

高血壓病早期中醫(yī)辨證主要為 “肝陽上亢”，并兼有 “肝腎陰虛， 瘀阻絡脈”， 故對其治療當以補瀉同施，滋補肝腎，清肝平陽，通絡逐瘀。潛陽育陰顆粒取山萸肉、玄參、制首烏滋補肝腎，并可滋陰涵陽;川牛膝、澤瀉泄?jié)?、引火下?又有鬼針草、川牛膝通絡逐瘀，條暢經脈。此方 “三補”、 “二瀉” 暗合六味地黃丸三補三瀉之意， 澤瀉、鬼針草、玄參兼瀉火，故全方補瀉同施、寓補于瀉，寓瀉于補，共奏清肝瀉火，滋水涵木，通脈逐瘀，正合高血壓病早期腎損害者之候。本實驗結果證明潛陽育陰含藥血清對 AngⅡ誘導體外培養(yǎng)的HUVEC損傷具有保護作用，其可能的機制是通過抑制 NADPH氧化酶活性，上調 eNOS 的蛋白表達，介導NO的產生，從而改善由高血壓所致的血管內皮細胞功能障礙。

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Impact of Qianyang Yuyin Granules containing serum on AngⅡ inducing HUVEC injuring NO

WANG Xin-tong1， FANG Zhu-yuan1*， YAN Shi-hai1， CHEN Yi2， ZHANG Si-qi2

（1.Jiangsu Provincial Hospital of TCM， Nanjing 210029， China;2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

AIM To study the impact of serum containing Qianyang Yuyin Granules（ Bidens bipinnata Linn，Cyathulae Radix， Corni Fructus， Scrophulariae Radix， Polygonimultiflori Radix praeparata， Alismatis Rhizoma）on vascular endothelial cells.METHODS The apoptosismodel of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） was established by AngⅡ induction.TBA meathod was used for NOmeasurement.Western blotwas used for the contents of eNOS and iNOS， and ELISA for the content of NADPH oxidase， respectively.Software SPSS17.0 was used to perform statistical analysis.RESULTS The protein expressions of NO and eNOS in the model group decreased compared with the normal group while NADPH oxidase increasedmarkedly.The NO level in the valsartan group and high dose Qianyang Yuyin Granules group obviously increased except in the lower doses group， which did not show obvious difference.Valsartan group and Qianyang Yuyin Granulesmade the protein expression of eNOS go up and the NADPH oxidase levelmarkedly go down with statistical difference.The expression of iNOS showed no difference among groups.CONCLUSION Qianyang Yuyin Granules have a Valsartan-like protective effect on AngⅡ-induced injury to cultured HUVEC in vitro.

Qianyang Yuyin Granules;Valsartan;human umbilical vein endothelial cells（ HUVEC）; AngⅡ;NO

R285.5

:A

1001-1528（2014）12-2467-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.005

2013-11-29

教育部博士點專項課題項目資助 （20123237110005）; 國家自然基金課題資助 （81273713）

王欣彤 （1988—）， 女， 碩士生， 研究方向: 心血管疾病。 Tel:15850520209

*通信作者: 方祝元， 主任中醫(yī)師， 博士生導師， 研究方向: 心血管疾病的治療。 E-mail:jsfy@jsmail.com.cn