馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸的測定

楊媛媛， 陳志永， 廖立平，3， 張紫佳，3*， 王崢濤，3

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 3.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心， 上海201203）

馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸的測定

楊媛媛1， 陳志永2， 廖立平2，3， 張紫佳2，3*， 王崢濤2，3

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 3.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心， 上海201203）

目的 建立馮了性風(fēng)濕跌打藥酒 （丁公藤、麻黃、桂枝、 澤瀉、 厚樸、 木香等） 中主要活性成分東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸的測定方法。 方法 采用 HPLC法， 用 Agilent Poroshell120 EC-C18柱對馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中東莨菪素、 東莨菪苷和綠原酸進(jìn)行測定。 用甲醇-0.1%甲酸水作流動相， 梯度洗脫， 體積流量 1 mL/min， 檢測波長 360 nm。結(jié)果 東莨菪素在 0.008 1 ～0.81 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， r=0.999 9， 平均回收率為 98.5%， RSD為 0.4%； 東莨菪苷在 0.026 8 μg～2.68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， r=0.999 9， 平均回收率為 99.2%， RSD為 1.6%； 綠原酸在0.027 04 ～2.704 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， r=1， 平均回收率為 98.3%， RSD為 0.8%。 結(jié)論 本方法簡單可行， 重復(fù)性好，可作為馮了性風(fēng)濕跌打酒的質(zhì)量控制方法。

馮了性風(fēng)濕跌打藥酒；東莨菪素；東莨菪苷；綠原酸

馮了性風(fēng)濕跌打藥酒為 《中國藥典》 2010 年版收載品種，由丁公藤、麻黃、桂枝、澤瀉、厚樸、 木香等27味中藥組成。 具有疏風(fēng)通絡(luò)、 散寒止痛的功效，用于治療風(fēng)寒濕痹、四肢麻木、筋骨疼痛、 腰背酸痛［1］。 丁公藤為方中君藥， 在我國廣西、廣東等地區(qū)有悠久的藥用歷史，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)痛，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)丁公藤在治療免疫相關(guān)疾病和神經(jīng)功能障礙方面有一定的作用［2-5］。 其含有的東莨菪 素、 東莨菪 苷和綠原酸為馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中主要祛風(fēng)濕活性成分［6-9］。 《 中國藥典》 中 尚未見該 制 劑 中成分的定量測定方法。馮了性風(fēng)濕跌打藥酒及主藥丁公藤中東莨菪素 的 測 定方 法 已 經(jīng) 有 相 關(guān) 報 道［10-14］。 但 其主要活性成分東莨菪苷和綠原酸的測定方法尚未有報道。本實(shí)驗(yàn)建立東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸的測定方法，可作為馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的質(zhì)量控制方法參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀 （ 美國安捷倫公 司， 型 號 1260 系 列 ）， 電 子 天 平 （ Sartorius BP211D），超聲波清洗器 （美國 Branson 公司， 型號 B5510E， 頻率 40 kHz）。

1.2 試 藥 對 照 品 東 莨 菪 素 （ 批 號 110768-200504） 和綠原酸 （110753-200413） 由中國藥品生物制品檢定所提供。東莨菪苷為本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到， 制備方法參考文獻(xiàn) ［15］報道， 純度在98%以上。 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒 （佛山馮了性藥業(yè) 有 限 公 司 生 產(chǎn)， 500 m L/瓶， 批 號 分 別 為120033、 120006、 110308、 120058、 120067、120064、120030、 120070、 120061、110297 ）。 甲醇為色譜純 （Fisher化學(xué)試劑公司）， 水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm × 4.6 mm， 2.7 μm）； 流動相 為甲醇（A） -0.1%甲酸水溶液 （ B） 梯度洗脫 （0 ～12 min， A為 15%； 12 ～15 min， A由 15% 遞 升 到30%；15 ～25 min， A為 30%；25 ～30 min，A由30%遞升到 80%； 30 ～35 min， A由 80%遞減至15%； 35 ～40 min， A為 15%）； 檢 測 波 長 360 nm； 體積流量 1 mL/min；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。 在此色譜條件下， 其他成分對東莨菪素、 東莨菪苷和綠原酸的測定無干擾，對照品、樣品及陰性對照色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 （A）， 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒 （B） 及陰性對照 （C） 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s of m ixed reference substances（ A） ， Fengliaoxing Fengshi Dieda W ine（B） and negative sample（C）

2.2 供試品溶液的制備 精密量取馮了性風(fēng)濕跌打藥酒 25 mL， 置 50 m L量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 過 0.45 μm 微 孔 濾膜， 取 續(xù) 濾 液，即得。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取東莨菪苷、 東莨菪素和綠原酸的對照品適量，加80%甲醇水溶液溶解制成東莨菪苷 （134.0 μg/mL）， 東莨菪素 （40.5 μg/mL） 和綠原酸 （135.2 μg/mL） 溶液， 即得。

2.4 線性關(guān)系考察 取上述對照品溶液， 分別稀釋 2 倍、 4 倍、 20 倍、 100 倍。分別進(jìn)樣 10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。 東莨菪苷： Y=965X +1.498， r=0.999 9， 在 0.026 8 ～2.68 μg范圍內(nèi)線 性關(guān)系良好。 東莨 菪素： Y=265 2X+ 0.453， r=0.999 9， 在 0.008 1 ～0.81 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 綠原酸： Y=597X+0.140， r= 1， 在 0.027 04 ～2.704 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取東莨菪素、 東莨菪苷和綠原酸對照品溶液各 10 μL， 連續(xù)進(jìn)樣 5 次， 測量峰 面 積， 結(jié) 果 RSD 分 別 為 0.36%、 0.89%、0.72%， 表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品 （批號110297）溶液10 μL， 分別在第0、 4、8、 12、24、48 h進(jìn)樣測定， 結(jié)果表明東莨菪素、 東莨菪苷和綠原 酸 峰 面 積 的 RSD分 別 為 0.74%、 0.98%、0.72%， 表明供試品溶液在 48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù) 性 試 驗(yàn) 取 同 一 批 號 樣 品 （ 批 號110297）， 按供試品溶液制備項(xiàng)下制備， 平行制備6份，按以上色譜條件測定，東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸峰面積的 RSD分別為 1.42%、 1.35%和1.27%， 結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含有量的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒 （批號 110297） 2 mL， 精密加入一定量的東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸對照品。按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，每一濃度制備3份樣品， 按色譜條件測定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見表1。

表 1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=3）Tab.1 Results of recovery tests（n=3）

2.9 陰性對照 取不含丁公藤的其他 26 味中藥制成陰性空白樣品，按樣品溶液制備方法，制成陰性空白溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，在對照品相應(yīng)位置無對照品峰出現(xiàn)，說明陰性空白樣品不干擾樣品測定。

2.10 樣品測定 分別精密吸取對照品和供試品溶液 （10 批次）各 10 μL， 進(jìn)樣。按上述色譜條件進(jìn)樣，每批次制備樣品3次，以外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見表2。

表2 馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中東莨菪素、 東莨菪苷和綠原酸測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Determ ination of scopoletin， scopolin and chlorogenic acid in Fengliaoxing Fengshi Dieda W ine（n=3）

3 討論

3.1 對照品制備溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)中的對照品制備項(xiàng)下選擇用 80%甲醇水溶液溶解對照品， 在用純甲醇溶液溶解時東莨菪素和東莨菪苷峰形不對稱， 所以最后選擇峰形對稱， 溶解性好的 80%甲醇水溶液溶解對照品。

3.2 檢測波長的選擇 《中國藥典》 2010 年版一部 “丁公藤” 中總東莨菪內(nèi)酯含量測定項(xiàng)下的檢測波長為 298 nm， 但馮了性風(fēng)濕跌打藥酒由 27 味中藥提取而成， 組成成分復(fù)雜，在 298 nm下檢測3 個待測峰受到雜質(zhì)峰干擾。 本實(shí)驗(yàn)選擇 360 nm為檢測波長，在此波長下干擾較少，有利于更準(zhǔn)確地進(jìn)行定量測定。

馮了性風(fēng)濕跌打藥酒由 27味中藥提取而成，成分復(fù)雜，質(zhì)量控制具有一定的難度。質(zhì)控方法不健全造成了不同批次馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中主要活性成分含有量上的差異。目前已有報道的質(zhì)控方法主要針對其活性成分東莨菪素，往往忽略了其中含有的大量的具有抗炎活性的綠原酸類成分。本研究建立了馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中東莨菪素、東莨菪苷和綠原酸的 HPLC聯(lián)合測定方法。 方法學(xué)考察證明此方法簡單、重復(fù)性好，可用于馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的質(zhì)量控制。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 661-662.

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Determ ination of scopoletin， scopolin and chlorogenic acid in Fengliaoxing Fengshi Dieda W ine

YANG Yuan-yuan1， CHEN Zhi-yong2， LIAO Li-ping2，3， ZHANG Zi-jia2，3*， WANG Zheng-tao2，3
（1.Laboratory of Pharmacokinetics for Chinese Materia Medica， ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine， Shanghai201203， China； 2.The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicinesand The ShanghaiKey Laboratory for Compound ChineseMedicines， Instituteof ChineseMateria Medica， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201210， China； 3.Shanghai R&D Centre for Standardization of Chinese Medicines， Shanghai 201210， China）

Fengliaoxing Fengshi Dieda Wine； scopoletin； scopolin；chlorogenic acid

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0551-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.022

2013-04-16

上海市科技啟明星跟蹤項(xiàng)目 （11QH1402200）

楊媛媛 （1988—） ， 女， 碩士。 E-mail： chenzhiyong0612@sina.com

*通信作者： 張紫佳， 副研究員， 研究方向： 中藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 Tel： （021） 51322513 ， E-mail： 18721608946@163.com