紅芪替代補中益氣湯中的黃芪對老齡小鼠脾T淋巴細胞的影響

邢文婷， 張李峰， 衛(wèi)東鋒， 程衛(wèi)東，4*， 杜 娟

（1.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所， 甘肅 蘭州730000； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100700； 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 5.甘肅中醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

紅芪替代補中益氣湯中的黃芪對老齡小鼠脾T淋巴細胞的影響

邢文婷1， 張李峰2， 衛(wèi)東鋒3， 程衛(wèi)東1，4*， 杜 娟5

（1.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所， 甘肅 蘭州730000； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100700； 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 5.甘肅中醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

目的 比較含紅芪與含黃芪的補中益氣湯含藥血清對老齡小鼠脾 T淋巴細胞作用的影響。 方法 通過 MTT法檢測含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清對老齡鼠脾淋巴細胞的刺激增殖作用，確定最佳稀釋濃度和作用時間；比較含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清對脾 T淋巴細胞的增殖能力、 T淋巴細胞亞群百分比及細胞培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平。 結(jié)果 當含藥血清質(zhì)量分數(shù)為 40%， 時間為 48 h 時， 補中益氣湯含藥血清對老齡小鼠脾淋巴的促增殖作用最佳。含紅芪與含黃芪的補中益氣湯含藥血清均可改善老齡鼠脾 T淋巴細胞的增殖、 T細胞亞群中 CD28+T淋巴細胞數(shù)及細胞培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平。 含紅芪的補中益氣湯在提高老齡小鼠 T淋巴細胞的增殖能力和 IL-2 的分泌方面優(yōu)于含黃芪補中益氣湯 （P＜0.01）。 結(jié)論 含紅芪與含黃芪的補中益氣湯均可通過調(diào)節(jié) T淋巴細胞起到一定的抗免疫老化的作用， 且含紅芪的補中益氣湯在促進脾細胞增殖和分泌 IL-2 方面優(yōu)于含黃芪的補中益氣湯， 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

紅芪；黃芪；補中益氣湯；老齡小鼠脾T淋巴細胞；抗免疫老化

紅芪與黃芪同科異屬，是甘肅優(yōu)質(zhì)道地藥材［1］。紅芪和黃芪的性味、 功效與主治基本相同，自古二者不分，在我國西北地區(qū)尤甚［2］。 但目前黃芪野生資源幾近枯竭，引種黃芪形態(tài)變異，混雜現(xiàn)象嚴重［3］， 無法滿足中藥材市場對中藥黃芪的需求量。因此合理開發(fā)中藥紅芪資源以彌補黃芪資源的緊缺，具有一定的科學(xué)和實際意義。研究表明紅芪和黃芪雖在成 分上有一定差異［4-5］， 但 均具有免疫調(diào)節(jié) 作 用［6-7］， 而 且 作 用 十 分 相 似［8-9］， 說 明紅芪在免疫功能方面替換黃芪具有可行性。

中醫(yī)防治疾病的主要臨床應(yīng)用形式是以君、臣、佐、使組方為特征的中藥復(fù)方，并不是單味藥的累加［10］， 因此有必要研究作用于復(fù)方中的紅芪和黃芪可否替換。以黃芪為君藥的補中益氣湯提高免疫力的 功 效 也 已 得 到 驗 證［11-13］， 且 紅 芪補 中 益氣湯與原方一樣具有免疫調(diào)節(jié)功能，用紅芪對T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于用黃芪［14］。 隨著人口老齡化的日趨加重，對衰老的研究也相應(yīng)增多。研究表明衰老過程中， 機體免疫系統(tǒng)最早最易受損［15］，且衰老和T淋巴細胞的關(guān)系已成為免疫老化學(xué)說研究的核心內(nèi)容［16］。

在前期工作中，實驗組已證實復(fù)方玉屏風(fēng)散用黃芪在免疫調(diào)節(jié)作用和抗免疫老化方面與用紅芪具有相似性［17］。 為探討在其他復(fù)方中紅、 黃芪的可替換性，本實驗進一步以相同劑量的紅芪代替黃芪，比較含紅芪與含黃芪補中益氣湯含藥血清對自然衰老小鼠脾T淋巴細胞的影響，研究其抗免疫老化作用。為開發(fā)紅芪的藥用價值提供可靠的理論依據(jù)，并為研究紅芪補中益氣湯和黃芪補中益氣湯抗免疫老化作用提供實驗室依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗藥物 經(jīng)典補中益氣湯由炙黃芪、 黨參、炙甘草、 白術(shù) （炒）、 當歸、 升麻、 柴胡、 陳皮組成，以同劑量紅芪代替黃芪，配伍成含紅芪的補中益氣湯。上述所用藥材均購自蘭州市藥材市場，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院程衛(wèi)東教授鑒定合格，所用藥物劑量參照 《中國藥典》 2010 年版［18］， 并根據(jù)體表面積［19］換算得出小鼠的灌胃劑量為 4 g生藥 /（kg·d）。 將兩組藥材各加適量水浸泡0.5 ～1 h，煎兩次 （1.5 h， 1 h）， 混合濾液， 濃縮至 1 g生藥/mL， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物 青齡健康昆明種小鼠 120 只， 體質(zhì)量18 ～22 g， 雌雄各半； 18 月齡健康昆明種老齡小鼠40 只， 體質(zhì)量 45 ～50 g， 雌雄各半， 上述小鼠均由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，合格號：SKXK（甘） 201106-0014。

1.3 試劑 胎牛滅活血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司）； 改良 RPMI-1640 培養(yǎng)基 （賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）； EZ-SepTMMOUSE IX淋巴細胞分離液 （深圳達科為生物技術(shù)有限公司）； MTT（美國 Sigma公司）； ConA （ 美國 Sigma公司）； SDS （ 天津化學(xué)試劑一廠）； FITC-抗小鼠CD3、 PE-抗小鼠 CD28 單克隆抗體 （ Biolegend 公司）； IL-2 酶聯(lián)免疫吸附 （ ELISA） 試劑盒 （ 深圳達科為生物技術(shù)有限公司）。

1.4 儀器 A06061422 超凈臺 （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； CO2培養(yǎng)箱 （日本 SANYO公司）；低溫冰箱 （日本 SANYO公司）；倒置顯微鏡 （德國 OLYMPUS 公司）； TDL-40B型和 TGL-16G型離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠）； 全自動酶標儀 （美國 BIO-RAD 公 司）；流 式 細 胞 儀 （美 國 貝 克 曼COULTER公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取 120 只健康昆明種小鼠隨機分為3組：紅芪補中益氣湯 （含紅芪的補中益氣湯水提物）、 黃芪補中益氣湯 （含黃芪的補中益氣湯水提物） 和空白血清組 （生理鹽水組）， 每組 40 只。 中藥組分別給予 4 g生藥/（kg·d）， 空白血清組給予 0.9%生理鹽水， 3 組灌胃量均為0.4mL/（20 g·d）， 每日 1 次，連續(xù) 15 d； 末次給藥后 1 h （灌胃前禁食， 自由飲水 12 h）［20］， 摘眼球取血， 待全血凝固后， 3 500 r/min 離心 15 min，收集血清，同組混合， 56 ℃、 30 min 水浴滅活后，用孔徑為 0.22 μm的濾器除菌分裝， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 老齡和青齡小鼠頸脫臼處死，超凈臺下無菌取其脾臟。嚴格按照EZ—SepTM小鼠淋巴細胞分離液的說明書提取脾淋巴細胞，制備老齡鼠和青齡鼠脾淋巴細胞懸液備用。

2.3 脾淋巴細胞增殖活性的測定［21］用完全 RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋上述 “2.1” 項制備好的紅芪補中益氣湯、黃芪補中益氣湯和空白血清組含藥血清， 使 含 藥 血 清 的 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為 1.25%、2.5%、 5%、10%、 20%、 40%、 80%。 調(diào)整上述“2.2”項制備的老齡鼠脾淋巴細胞懸液的細胞密度為 1 ×105個/mL， 加入 96 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔100 μL， 再加入 3 組不同質(zhì)量分數(shù)的含藥血清各100 μL， 每個質(zhì)量分數(shù)設(shè) 12 個復(fù)孔。同時設(shè)老齡組 （不加含藥血清老齡鼠脾淋巴細胞） 和青齡組（青齡鼠脾淋巴細胞）。 另設(shè)不同質(zhì)量分數(shù)含藥血清和只加完全 RPMI-1640 培養(yǎng)液的空白孔。 分別培養(yǎng)24 h、48 h 和 72 h 后， 加入終質(zhì)量濃度為 5 mg/mL的 MTT 20 μL， 孵育 4 h， 加入 100 μL 10%的 SDS， 吹打混勻， 37 ℃過夜， 于酶標儀 570 nm處測 OD值， 空白孔校正調(diào)零， 結(jié)果以 OD值表示。 根據(jù) MTT的結(jié)果選擇含藥血清的最佳稀釋質(zhì)量分數(shù)和培養(yǎng)時間，與老齡小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)用于下述實驗。

2.4 對 ConA誘導(dǎo)的老齡小鼠脾 T淋巴細胞體外增殖的測定［22］取 “2.2”項制備出的老齡鼠脾淋巴細胞懸液， 細胞密度調(diào)整為 2 ×105個/mL， 加入 96 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔 50 μL； 并分別加入“2.3” 項所確定的紅芪補中益氣湯、 黃芪補中益氣湯和空白血清組最佳質(zhì)量分數(shù)含藥血清，每孔50 μL。老齡組和青齡組脾細胞懸液每孔 50 μL。每組樣本 8 個復(fù)孔， 其中 4 孔加 ConA 100 μL， 4孔不加 ConA。 設(shè)每組最佳質(zhì)量分數(shù)含藥血清和只加 完 全 RPMI-1640 培 養(yǎng) 液 的 空 白 孔。 按 上 述“2.3”項所確定的最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng) 48 h 后， 各孔加 MTT 20 μL（終質(zhì)量濃度為 5 mg/mL）， 孵育4 h， 加 100 μL 10%的 SDS， 吹打混勻， 37 ℃過夜， 于酶聯(lián)免疫檢測儀 570 nm處測 OD值， 空白孔校正調(diào)零，實驗結(jié)果用 OD值表示。最后按以下公式計算剌激指數(shù)： 刺激指數(shù) =ConA誘導(dǎo)孔 OD均值/無 ConA孔 OD均值。

2.5 對老齡小鼠脾淋巴細胞 CD3 和 CD28 分子表達的測定 取上述 “2.2”項制備的老齡鼠脾淋巴細胞懸液， 調(diào)整細胞密度為 2 ×107個/mL， 加入24 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔 500 μL， 并 分別加入“2.3”項確定的紅芪補中益氣湯、 黃芪補中益氣湯和空白血清組最佳質(zhì)量分數(shù)含藥血清， 每孔 500 μL， 老齡組和青齡組脾細胞懸液每孔 500 μL， 五組樣本均設(shè)3個復(fù)孔。 培養(yǎng)48 h后， 收集細胞至2 mL離心管， 離心，將培養(yǎng)上清保留， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?0.01 mol/L PBS 洗滌細胞沉淀， 1 mol/L PBS 重懸， 調(diào)整細胞數(shù)約為 1 ×107個/mL。 取各組細胞懸液 100 μL， 分別加 FITC-抗小鼠 CD3 1 μL，PE-抗小鼠 CD28 2.5 μL，輕輕混合，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗 1 次細胞， 2 500 r/min 離心 5 min，棄上清， 細胞沉淀中加 500 μL PBS， 混勻， 上流式細胞儀檢測。

2.6 培養(yǎng)上清 IL-2 的測定 取 “2.5”項所得培養(yǎng)上清， 酶聯(lián)免疫吸附方法檢測培養(yǎng)上清 IL-2 的水平，操作步驟嚴格按說明書進行，結(jié)果經(jīng)酶標儀450 nm波長測定 OD值，并根據(jù)對照品繪制標準曲線， 計算其質(zhì)量濃度， 單位為 pg/mL。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對脾淋巴細胞增殖活性的影響 結(jié)果如表1所示，隨著含藥血清質(zhì)量分數(shù)的升高和細胞培養(yǎng)時間的延長，脾細胞的增殖活性先增加后減少。 在相同的培養(yǎng)時間下， 40%的含藥血清脾淋巴細胞增殖活性均高于其他質(zhì)量分數(shù)組，與相同質(zhì)量分數(shù)空白血清組比較，脾淋巴細胞增殖活性均顯著增高 （P＜0.01）， 且紅芪補中益氣湯優(yōu)于黃芪補中益氣湯 （P＜0.05）。 同時， 培養(yǎng) 48 h 的增殖活性優(yōu)于 24 h 和 72 h。 因此將含藥血清定為 40%，培養(yǎng)時間定為48 h作為后續(xù)實驗的研究條件。

表1 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清與脾細胞增殖的時效量效關(guān)系 （， n=10）Tab.1 Time-effect and concentration-response relationship of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and con taining Hedysari Radix on sp leen cells（， n=10）

表1 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清與脾細胞增殖的時效量效關(guān)系 （， n=10）Tab.1 Time-effect and concentration-response relationship of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and con taining Hedysari Radix on sp leen cells（， n=10）

注： 與青齡組比較，**P＜0.01； 與相同質(zhì)量分數(shù)的空白血清組比較，△△P＜0.01； 與相同血清質(zhì)量分數(shù)黃芪補中益氣湯比較，▲P＜0.05

不同培養(yǎng)時間脾細胞增殖活性24 h 48 h 72 h青齡組分 組 質(zhì)量分數(shù)/% 1.062 ±0.108 1.312 ±0.145 1.100 ±0.085老齡組 0.596 ±0.033** 0.682 ±0.075** 0.555 ±0.047**空白血清組 1.25 0.585 ±0.100 0.649 ±0.103 0.569 ±0.079空白血清組 2.5 0.580 ±0.057 0.684 ±0.119 0.611 ±0.073空白血清組 5 0.583 ±0.064 0.669 ±0.095 0.589 ±0.103空白血清組 10 0.609 ±0.070 0.681 ±0.092 0.623 ±0.111空白血清組 20 0.646 ±0.082 0.682 ±0.109 0.630 ±0.075空白血清組 40 0.651 ±0.074 0.737 ±0.040 0.646 ±0.045空白血清組 80 0.695 ±0.096 0.806 ±0.053 0.680 ±0.086黃芪補中益氣湯 1.25 0.584 ±0.078 0.647 ±0.103 0.587 ±0.065黃芪補中益氣湯 2.5 0.573 ±0.085 0.645 ±0.108 0.600 ±0.055黃芪補中益氣湯 5 0.583 ±0.076 0.707 ±0.125 0.589 ±0.068黃芪補中益氣湯 10 0.671 ±0.072 0.727 ±0.116 0.636 ±0.086黃芪補中益氣湯 20 0.754 ±0.071 0.822 ±0.118 0.797 ±0.125黃芪補中益氣湯 40 0.910 ±0.121△△ 0.984 ±0.029△△ 0.903 ±0.061△△黃芪補中益氣湯 80 0.750 ±0.109 0.793 ±0.149 0.786 ±0.130紅芪補中益氣湯 1.25 0.594 ±0.060 0.675 ±0.119 0.666 ±0.068紅芪補中益氣湯 2.5 0.696 ±0.057 0.657 ±0.077 0.651 ±0.071紅芪補中益氣湯 5 0.682 ±0.083 0.727 ±0.144 0.695 ±0.033紅芪補中益氣湯 10 0.741 ±0.129 0.720 ±0.145 0.698 ±0.108紅芪補中益氣湯 20 0.786 ±0.108 0.829 ±0.155 0.757 ±0.081紅芪補中益氣湯 40 0.949 ±0.107△△ 1.071 ±0.102△△▲ 0.946 ±0.045△△紅芪補中益氣湯80 0.770 ±0.077 0.875 ±0.079 0.777 ±0.084

3.2 對 ConA誘導(dǎo)的老齡小鼠脾 T淋巴細胞體外增殖的影響 結(jié)果如表2所示，與青齡組比較，老齡組脾淋巴細胞體外自身增殖、 ConA誘導(dǎo)增殖能力和刺激指數(shù)明顯降低 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清分別作用于老齡小鼠脾淋巴細胞，與空白血清組比較，增殖能力和刺激指數(shù)均升高 （P＜0.05）。且含紅芪補中益氣湯效果優(yōu)于含黃芪補中益氣湯 （P＜0.05）。

3.3 對老齡小鼠脾淋巴細胞 CD3 和 CD28 分子表達的影響 結(jié)果如表3所示，與青齡組比較，老齡組 CD3+CD28+T淋巴細胞亞群減少， CD3+CD28-T淋巴細胞亞群增多 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清作用于老齡小鼠脾淋巴細胞后， 與空白血清組比較， 脾淋巴細胞 CD28 分子的表達發(fā)生改變， CD3+CD28+T淋巴細胞亞群增多 （P＜0.05）。

3.4 對培養(yǎng)上清 IL-2 的影響 結(jié)果如表 4 所示，與青齡組比較， 老齡組體外分泌 IL-2 的水平明顯減少 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清分別與老齡小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)后，與空白血清組比較， 培養(yǎng)上清 IL-2 的水平增多 （ P＜0.01）。 含紅芪補中益氣湯優(yōu)于含黃芪補中益氣湯（P＜0.05）。

表 2 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對 T淋巴細胞增殖的影響 （ˉ， n=10）Tab.2 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on proliferative capacity of T lym phocytes（ ˉ， n=10 ）

表 2 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對 T淋巴細胞增殖的影響 （ˉ， n=10）Tab.2 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on proliferative capacity of T lym phocytes（ ˉ， n=10 ）

注：與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與黃芪補中益氣湯比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 劑量/（g·kg-1） 自身增殖 ConA誘導(dǎo)增殖 刺激指數(shù)青齡組 —1.180 ±0.177 1.976 ±0.135 1.702 ±0.199老齡組 — 0.669 ±0.114** 0.687 ±0.110** 1.029 ±0.026**空白血清組 4 0.671 ±0.091 0.702 ±0.086 1.049 ±0.067黃芪補中益氣湯 4 0.795 ±0.020△ 1.010 ±0.040△△ 1.270 ±0.036△紅芪補中益氣湯 4 0.902 ±0.008△△▲ 1.245 ±0.070△△▲▲ 1.380 ±0.075△△▲

表 3 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對 CD3+、 CD28+脾淋巴細胞亞群的影響 （， n=10）Tab.3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on CD3+and CD28+in sp leen T lym phocyte subgroups（， n=10）

表 3 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對 CD3+、 CD28+脾淋巴細胞亞群的影響 （， n=10）Tab.3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on CD3+and CD28+in sp leen T lym phocyte subgroups（， n=10）

注： 與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△P＜0.05

組 別 劑量/（g·kg-1） CD3+CD28-/% CD3+CD28+/%青齡組 —3.03 ±0.65 35.07 ±3.58老齡組 — 6.23 ±0.80** 26.12 ±2.03**空白血清組 4 5.97 ±1.11 26.33 ±2.17黃芪補中益氣湯 4 5.36 ±0.40 28.83 ±1.56△紅芪補中益氣湯 4 5.42 ±0.60 29.27 ±2.21△

表4 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對脾淋巴細胞培養(yǎng)上清 IL-2 水平的影響 （， n=10）Tab.4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on IL-2 leve1 of sp leen T lym phocytes（， n=10）

表4 含黃芪和含紅芪補中益氣湯含藥血清對脾淋巴細胞培養(yǎng)上清 IL-2 水平的影響 （， n=10）Tab.4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on IL-2 leve1 of sp leen T lym phocytes（， n=10）

注：與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△△P＜0.01； 與黃芪補中益氣湯比較，▲P＜0.05

組 別 劑量/（g·kg-1）IL-2/（pg·m L-1）青齡組 —112.64 ±10.02老齡組 — 15.73 ±3.64**空白血清組 4 16.65 ±5.36黃芪補中益氣湯 4 63.78 ±4.66△△紅芪補中益氣湯 4 71.00 ±6.87△△▲

4 結(jié)論

基于目前在免疫調(diào)節(jié)方面，對紅、黃芪單味藥和在復(fù)方中應(yīng)用的研究以及T淋巴細胞在抗免疫老化中所起的關(guān)鍵作用，實驗組前期研究表明紅芪替換黃芪應(yīng)用于復(fù)方補中益氣湯在細胞免疫調(diào)節(jié)方面具有相似性［14］，本實驗進一步選擇了以黃芪為君藥的補中益氣湯，用紅芪代替原方中黃芪配伍成含紅芪的補中益氣湯，對抗免疫老化作用進行了體外對比研究。 實驗選擇中藥血清藥 理學(xué)方 法［23］，用中藥復(fù)方水提物給小鼠灌胃制備含藥血清對細胞進行體外培養(yǎng)。 通過 MTT法觀察含藥血清作用于老齡鼠脾淋巴細胞刺激增殖作用，實驗結(jié)果表明以血清質(zhì)量分數(shù)為 40%的含藥血清培養(yǎng) 48 h 增殖效果最佳，且含紅芪補中益氣湯效果優(yōu)于含黃芪補中益氣湯。

T淋巴細胞功能變化對衰老有一定影響，是免疫老化 的突 出 表 現(xiàn)［24-25］。 隨著 年 齡 增長， 體 外 有絲分裂原刺激后細胞增殖能力降低［26］， 且 IL-2 的生成減少［27］。 刺激 T淋巴細胞體外增殖的絲裂原應(yīng)首選 ConA［28］。 本實驗再次用 MTT法觀察含藥血清作用于老齡鼠脾細胞對T淋巴細胞增殖的反應(yīng)， 結(jié)果表明， 兩方 40%的含藥血清對老齡小鼠脾細胞作用48 h， 均能不同程度地提高老齡鼠 T淋巴細胞自身增殖和 ConA誘導(dǎo)的增殖能力， 刺激指數(shù)也相應(yīng)增加，且紅芪補中益氣湯的作用更好。

伴隨年齡的增長，T淋巴細胞功能相關(guān)的許多分子發(fā)生改變， CD28-T細胞頻率是老年個體免疫功能不全的關(guān)鍵預(yù) 報因子［29-30］。 CD28 分子 的減少已作為免疫老化的重要標志之一［30］， 在細胞復(fù)制性衰老的進程中起關(guān)鍵作用［31］。 本實驗將含紅芪與含黃芪補中益氣湯含藥血清與老齡小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)后， 發(fā)現(xiàn)加藥老齡鼠脾細胞 CD3+CD28+T淋巴細胞數(shù)量較不加藥老齡組增加， CD3+CD28-T淋巴細胞數(shù)減少， 紅芪補中益氣湯與黃芪補中益氣湯作用相似。

IL-2 主要由活化的 CD4 和 CD8 T細胞產(chǎn)生，是參與免疫應(yīng)答的重要細胞因子［32］。 隨著年齡的增長， 機體 T淋巴 細 胞 分泌 IL-2 的 能 力明 顯 減弱［33］。本實驗結(jié)果也證實老齡組脾淋巴細胞的培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平減少， 分別與紅芪和黃芪補中益氣湯含藥血清作用后，老齡小鼠T淋巴細胞分泌的 IL-2 的能力增強， 且紅芪補中益氣湯作用效果優(yōu)于黃芪補中益氣湯。

綜上所述，紅芪補中益氣湯與黃芪補中益氣湯均可通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞在抗免疫老化方面起到一定作用，二者作用相似，且紅芪補中益氣湯在促進脾細胞增殖和分泌 IL-2 方面優(yōu)于黃芪補中益氣湯，因此紅芪代替補中益氣湯中黃芪在抗免疫老化方面具有可行性。本研究為開發(fā)甘肅道地藥材紅芪的藥用價值及深入研究紅芪與黃芪在復(fù)方中的抗免疫老化機制提供了實驗依據(jù)。

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Substitution of Hedyseri Radix for Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction results in change of sp leen T lym phocytes of aging m ice

XINGWen-ting1， ZHANG Li-feng2， WEIDong-feng3， CHENGWei-dong1，4*， DU Juan5
（1.Instituteof Integrated Chineseand Western Medicine， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 2.Immunologic Institute， Schoolof Basic Medical Science， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 3.Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700， China； 4.Institute of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 5.College of Nursing，Gansu College of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

AIM To study the effect of the substitution of Hedysari Radix for Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction on spleen T lymphocytes of agingmice.M ETHODS MTTmethod was used to detect the proliferation of the serum from both Hedyseri Radix and AstragaliRadix of Buzhong YiqiDecoction acting on spleen lymphocyte in aged mice， and to determine the optimum incubation time and serum concentrations.The comparison wasmade with the proliferative capacity of T lymphocytes， the percentage of T-lymphocyte subsets and the level of IL-2 in the culture supernatant.RESULTS MTT results showed that 40%of drug concentration with serum training 48 h stimulated proliferation bestby acting on spleen lymphocyte in agedmice.While both could significantly increased T lymphocyte proliferation， the T lymphocyte count of CD28+in T lymphocyte subgroup， and the level of IL-2. Hedysari Radix was superior to Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction in raising T lymphocyte proliferation and IL-2 leve1.CONCLUSION Buzhong Yiqi Decoction containing Hedysari Radix has a similar role in anti-immunosenescence as Astragali Radix， and Hedysari Radix is statistically better in terms of T cell proliferation and IL-2 leve1.

Hedyseri Radix； Astragali Radix； Buzhong Yiqi Decoction； spleen T lymphocytes of aging mice；anti-immunosenescence

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0450-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.003

2013-06-17

國家自然科學(xué)基金面上項目 （81373806） ； 2012 年省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研立項課題 （ GZK-2012-43） ； 蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助 （ lzujbky-2013-172）

邢文婷 （1988—） ， 女， 碩士生， 從事中西醫(yī)結(jié)合臨床研究。 TeL： 18298331246， E-mail： xingwentinghaha@126.com

*通信作者： 程 衛(wèi)東 （ 1963—） ， 男， 教 授， 博 士， 博士 生 導(dǎo) 師， 從事中 西 醫(yī) 結(jié)合治 療 常 見 病 研 究。 Tel： （ 0931 ） 8915184， E-mail：chengweidong888@sina.com